凋亡相关基因Survivin、Caspase-3和Caspase-7在非小细胞肺癌组织中的表达及意义

摘要

细胞周期进程和凋亡控制被认为是在保持细胞数量动态平衡和组织形态发生中密切关联的过程，凋亡抑制对肿瘤发生和发展极其重要。1997年Ambrosini等用效应细胞蛋白酶受体1(Effector Cell Protease Receptor-1，EPR1)探针与人类基因组文库杂交，分离到了一编码凋亡抑制蛋白的cDNA，定义为survivin。Survivin作为凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis proteins，IAP)的新成员因其独特的分子结构和生物学功能在肿瘤分子生物学研究中倍受关注。近来多项研究表明survivin不仅抑制凋亡，也参与细胞有丝分裂、加速肿瘤细胞增殖，在细胞凋亡和细胞周期的基因调控中发挥重要作用。但survivin基因在肺癌发生中的作用及作用途径报道甚少且存在争议。 肺癌系世界上发病率最高的恶性肿瘤之一，但目前肿瘤的生物学行为无明确指标，本研究用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测了32例肺癌组织，10例病灶旁正常肺组织survivin mRNA、caspase-3 mRNA，caspase-7 mRNA表达的表达并进等相关性分析，以探讨survivin基因在肺癌发病机制中的作用，及其与caspase-3、caspase-7表达的相互关系，为今后以survivin基因为靶器对肺癌进行基因治疗提供理论依据。 材料与方法: 一、材料 RT-PCR实验组收集2006-2007年202医院，省肿瘤医院手术切除并经病理证实的NSCLC标本32例，男性26例，女性6例，平均年龄55.78岁(年龄41-73岁)。正常对照组：距病灶边缘10cm以上正常肺组织标本10例。组织离体后在1小时内放入液氮速冻，在-80℃冰箱保存。 肺癌按1997年的TNM分期方法进行分期，其中Ⅰ期、Ⅱ期16例Ⅲ期16例，无0期和Ⅳ期病例，按病理形态学分：鳞状细胞癌25例，腺癌7例。按分化程度分为：高、中分化21例，低分化11例。所有患者均为原发性肺癌，术前均未接受过化疗或放疗等任何治疗。 二、方法 1．RT-PCR检测Survivin、Caspase-3、Caspase-7基因表达 取组织50-100mg，加入1mlTrizolTM在玻璃匀浆器中彻底匀浆。TrizolTM试剂盒说明书用两步法提取总RNA，用紫外分光光度仪(德国JENWAY-Genova公司产品)测定RNA的浓度和纯度。Survivin基因引物序列为5'-CAG GCG GTG ATGTGG ATC-3’(上游)和5'-GTT TGG CTT GCT GGT CTC-3’(下游)扩增片段长度为398bp。Caspase-3基因引物序列为5'-TGT GGCATT GAGACAGAC-3’(上游)和5'-CAC TTG CCA TAC AAA CTA-3’(下游)扩增片段长度为371bp。Caspase-7基因引物序列为5'-TGACCTATC CTG CCC TCA-3’(上游)和5'-TCTCCT GCC TCA CTG TCC-3’(下游)扩增片段长度为107bp，β-actin为内对照，在25ul反应体系中含有2.5mmol/LdNTP2ul、20pmol/L上下游引物各0.5ul，cDNAl ul、PfuDNA聚合酶1.25U(0.25u1)、5xPfuDNA聚合酶缓冲液2.5ul。 PCR反应条件为：Survivin：94℃，3min(94℃，40sec；54.5℃，1min，72℃，1min共35个循环)72℃，7min。Caspase-3：94℃，3min(94℃，40sec；48℃，1min，72℃，1min共35个循环)72℃，7min。Caspase-7：94℃，3min(94℃，40see；53℃，1min，72℃，1min共35个循环)72℃，7min参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)检测逆转录效率。 PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳。用G：BOX(GeneSnap成像分析系统)进行摄像分析。用DL2000DNA Markers为分子大小对照确定阳性琼脂糖凝胶电泳条带。 2．统计学处理采用X<'2>检验，P<0.05具有统计学意义。 结论: 1．Survivin基因选择性的在NSCLC组织中表达上调，提示Survivin基因可能通过抑制肺癌细胞凋亡，对肺癌的发生发展起重要作用Survivin基因有望成为肺癌诊断和治疗的新靶点 2．Survivin基因与caspase-3，caspase-7基因的表达呈负相关，Survivin基因可能直接抑制caspase-3、 caspase-7基因活性，抑制了细胞的凋亡过程，从而促进了NSCLC的癌细胞不断增生。

目录

中国医科大学研究生学位论文独创性声明及版权使用授权书

中文论著摘要

英文论著摘要

英文缩略语

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 Survivin基因与肺癌

致谢

个人简介