凋亡相关基因bax、caspase-3在非小细胞肺癌中的表达及临床意义研究

摘要

1.背景：
　　 肺癌发病率逐年增高,死亡率居高不下是每个呼吸科医生面临的巨大问题。我国肺癌发病率近几十年来上升4倍,北京肺癌发病率10年间增加6成,发病率的上升,加上未能早期发现,肺癌仍是肿瘤死亡的首要原因。而非小细胞肺癌占肺癌的比例大,且对放化疗不敏感,首选手术治疗,但大多数肺癌患者发现时已经错过最佳手术时机,故加强对肺癌的研究,提高早期诊断率,寻找更好的有针对性治疗方法是很有必要的。肿瘤的发生多为细胞增殖、分化异常,凋亡受抑、细胞死亡不足导致。凋亡异常在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用。凋亡抑制基因、凋亡促进基因及凋亡效应基因的上调及下调,都可能打破细胞生成与死亡的平衡。肿瘤即为此平衡打破后所造成的细胞的异常增殖与死亡。近年来对凋亡相关基因的研究越来越多,且大多数仍处于实验室研究阶段,未能为临床患者造福。提高肿瘤的诊断率、降低肿瘤的死亡率需要我们加快对肿瘤凋亡相关基因的研究。目前肿瘤非手术(如放疗、化疗)治疗原理主要就是诱导细胞凋亡,但它没有很明显的目的性,在杀死肿瘤细胞的同时,不可避免的杀死人的正常细胞,以致副作用太大,不能被耐受。肿瘤的发生、发展毫无质疑受多种基因的调控,相互影响,相互关联。本文主要研究bax与caspase-3与非小细胞肺癌的关系,及相互关系。Bax为凋亡促进基因,目前对它与肺癌的研究并不少见,但多为单基因研究,或与bcl-2联合的经典研究。但与效应基因caspase-3共同研究在国内外都很少见。
　　 2.对象与方法：
　　 2.1研究对象
　　 本实验随机选取郑州大学第一附属医院病理科2009-2011年经外科切除的非小细胞肺癌标本,共60例。年龄在36-87岁之间,鳞癌30例,腺癌30例,所有病人在术前均未接受化疗,病理诊断明确。TNM分期按照美国联合癌症分类委员会和国际抗癌联盟制定的分期标准。另随机选取其中20例的癌旁正常组织(经病理证实)作为对照组,所有标本均为蜡块包埋,由专业人员切片,每例3片。
　　 2.2方法
　　 检测bax及caspase-3在肺癌组织及癌旁正常组织中的表达采用免疫组织化学方法(S-P法)。检测凋亡细胞采用TUNEL法。
　　 2.3结果判定
　　 bax的阳性标准:bax染色为细胞质或(和)细胞膜出现棕黄色颗粒,首先看颜色,颜色与背景染色无明显差别为0分,浅棕黄色,与背景颜色有差别,为1分,染为棕黄色,介于1与3分之间,为2分,染为深棕黄色,与背景颜色差别显著为3分,其次看染色细胞比例,高倍镜(400倍)下每个视野计数100个细胞,每张切片数5个视野,阳性细胞数占总癌细胞百分比。0％为0分,0%-10%为1分,10%-50%为2分,>50%为3分,两者所得数值相加的分值结果为总分值,总分值<4为阴性,≥4为阳性。Caspasc-3的阳性标准:染色为细胞质或(和)细胞核出现棕黄色颗粒,定位准确且无背景染色,余判定步骤同bax。
　　 2.4凋亡
　　 凋亡细胞经TUNEL法处理后,细胞核被染为棕黄色,使用光学显微镜,在高倍镜下任选10个视野,每个视野计数100个细胞,得出AI。AI为计数每1000个肿瘤细胞中凋亡细胞所占的比例。
　　 2.5统计学处理
　　 本实验所有统计均应用spss17.0软件包处理,α=0.05为检验水准。Bax与caspase-3的表达及与临床病理特征的关系采用配对四格表的卡方检验,其中caspasc-3的表达与胸腔积液的关系采用连续性校正的卡方检验(因表示有胸腔积液者阳性的格子期望频数为4.4,小于5)。寻找Bax与caspase-3在非小细胞肺癌中表达的相关性时应用配对资料的相关性分析,其与凋亡的关系采用直线相关性分析。
　　 3.结果：
　　 3.1 Bax的表达
　　 Bax经免疫组化后,细胞膜和(或)细胞质被染成棕黄色,肺癌组织60例,阳性率为48.3%,癌旁正常组织20例,阳性率为60%,经统计学分析,两者差别无统计学意义(x2=0.419,P=0.517),但癌组织的染色均要深于癌旁正常组织。结果显示,高分化组织的阳性表达率(93.3%)要高于中低分化(37.8%),差异有统计学意义(x2=13.904,P=0.000)。有淋巴结转移者阳性率(33.3%)较无淋巴结转移者(66.7%)低,差异有统计学意义(x2=6.607,P=0.010)。TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期阳性率(61.5%)要高于Ⅲ,Ⅳ阳性率(33.3%),差异有统计学意义(x2=4.348,P=0.037)。Bax的表达与年龄、性别、病理分型、是否合并胸腔积液、肿瘤直径、是否吸烟、肿瘤生长在左肺还是右肺无明显关系(P>0.05)。
　　 3.2 caspase-3的表达
　　 caspase-3经免疫组化后,细胞核和(或)细胞质被染成棕黄色,肺癌组织60例,阳性率为40%,癌旁正常组织20例,阳性率为40%,经统计学分析,两者差别无统计学意义(x2=0.000,P=1.000)。结果显示,有淋巴结转移者阳性率(7.4%)较无淋巴结转移者(66.7%)低,差异有统计学意义(x2=21.728,P=0.000)。TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期阳性率(56.4%)要高于Ⅲ,Ⅳ阳性率(9.5%),差异有统计学意义(x2=12.50,P=0.000)。Caspase-3的表达与年龄、性别、病理分型、分化程度、是否合并胸腔积液、肿瘤直径、是否吸烟、肿瘤生长在左肺还是右肺无明显关系(P>0.05)。
　　 3.3非小细胞肺癌组织中bax与caspase-3表达的关联性分析
　　 Bax为凋亡促进基因,caspase-3为凋亡效应基因,和其他凋亡相关基因共同介导着肺癌细胞的凋亡。实验结果示肺癌组织中,bax阳性32例,easpase-3阳性25例,两者共同表达阳性22例,bax阴性28例,caspase-3阴性35例,两者共同表达阴性25例,应用配对资料的相关性分析示,两者具有明显相关性,成正相关(r=0.587 P=0.000)。
　　 3.4 Bax、gaspase-3与凋亡之间的关系
　　 统计学分析得出:Bax的表达与细胞凋亡呈正相关(r=0.855,P=0.000),caspase-3的表达与细胞凋亡呈正相关(r=0.8343,P=0.ooo)。
　　 4.结论：
　　 1.bax、caspase-3的表达下调提示非小细胞肺癌的恶性程度及预后。
　　 2.bax与caspase-3在非小细胞肺癌中的发生、发展中起着协同的作用。
　　 3.Bax、caspase-3与细胞凋亡密切相关,修复此基因有望促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤发展。