eNOS基因转移联合西地那非对大鼠低氧性肺动脉高压的预防作用

摘要

本文拟建立大鼠低氧性PH模型，应用携带人类eNOS基因的重组腺病毒AdCMVceNOS基因导入，并联合口服枸橼酸西地那非，通过血流动力学、组织学、生化学、分子生物学等方法，研究腺病毒介导eNOS基因转移联合西地那非，预防急性低氧性肺血管收缩(HPV)和慢性低氧性肺动脉高压(CHPH)的可行性、疗效及相关毒副作用，为此法用于临床奠定理论基础，为PH治疗开创出更为安全有效的新方法。 研究材料： 1、实验材料： 重组腺病毒载体AdCMVceNOS病毒DNA 由Dr Robert Gerard惠赠重组腺病毒载体AdCMVLacZ 东方肝胆医院惠赠pXC1载体加拿大Microbix Biosystems公司腺病毒E1区转化人胚胎肾细胞株293 加拿大Microbix Biosystems公司引物Vt01、Vt02、Vt001和Vt002 Takara公司合成I125-cGMP放射免疫试剂盒上海中医药大学小鼠抗人eNOS单克隆抗体 BD公司一氧化氮试剂盒南京建成生物工程研究所免疫组化试剂盒北京中杉生物技术公司弹力纤维染色试剂盒北京中杉生物技术公司ECL试剂盒北京中杉生物技术公司X-gal(5-溴-4-氯-β-吲哚-p-半乳糖苷) Takara公司枸橼酸西地那非辉瑞制药公司10％氮氧混合气沈阳液化空气有限公司100％氮气沈阳液化空气有限公司。 2、实验设备PCR仪德国BIOMETRA公司N02120MAX21g电子天平 NAVIGATOR公司TDL-40B离心机上海安亭科学仪器有限公司721型分光光度计上海精密科学仪器有限公司GC-2016放射免疫计数器科大创新股份有限公司TKR-200C小动物呼吸机江西特力麻醉呼吸设备有限公司。 3、实验动物Wistar大鼠126只沈阳军区总医院实验动物中心 研究方法： 1、第一部分： (1)AdCMVceNOS病毒DNA用脂质体法体外转染293细胞，且在细胞内部包装。经PCR鉴定后在293细胞株内扩增，继而经CsC1密度梯度离心纯化及TCID50法测定滴度。 (2)雄性Wistar大鼠54只，随机分为对照(C)组、Ad-Lacz组和Ad-eNOS组，每组18只。分别应用病毒保存液、5×10<'9>PFU/mlAdCMVLacZ和AdCMVceNOS各600u1经气管导管注入大鼠肺脏。3、5和17天后，每组各取6只，测定HR和血压，并行肺组织X-gal染色、eNOS免疫组化染色、HE染色、eNOS Westemblot检测及cGMP和NO含量测定。转染病毒后5天的大鼠，同时行肝、脾、肾脏的组织化学染色。 2、第二部分： 雄性Wistar大鼠36只，随机分为常氧(N)组、低氧(H)组、低氧LacZ(H-LacZ)组、低氧eNOS(H-eNOS)组、低氧西地那非(H-S)组和低氧eNOS-西地那非(H-eNOS-S)组，每组6只。首先经气道转基因(N、H和H-S组应用病毒保存液，H-LacZ组应用5×10<'9>PFU/ml AdCMVLacZ 600μl，H-eNOS和H-eNOS-S组应用5×10<'9>PFU/ml AdCMVceNOS 600gl经气管导管注入大鼠肺脏)。3天后，N组常氧(吸入空气)30min，其它组大鼠急性低氧(吸入10％氧气)30min。H-S和H-eNOS-S组大鼠在低氧前30min，应用0.3％西地那非25mg/kg灌胃，其它组大鼠灌入等量生理盐水(8.33ml/kg)。低氧结束后，测定大鼠体循环血压(SAP)、HR和MPAP，动脉血气分析，检测肺组织cGMP、NO含量。 3、第三部分： 雄性Wistar大鼠36只，随机分为常氧(N)组、低氧(H)组、低氧LacZ(H-Lacz)组、低氧eNOS(H-eNOS)组、低氧西地那非(H-S)组和低氧eNOS-西地那非(H-eNOS-S)组，每组6只。首先经气道转基因(N、H和H-S组应用病毒保存液，H-LacZ组应用5×10<'9>PFU/ml AdcMVLacz 600μl，H-eNOS和H-eNOS-S组应用5×10<'9>PFU/ml AdCMVceNOS 600μl经气管导管注入大鼠肺脏)。之后常氧饲养3天，每日灌胃1次。3天后，N组常氧处理(吸入空气)2周，其它组慢性常压低氧处理(吸入10％氧气，每天8h)2周，并于每日低氧前30min灌胃。H-S和H-eNOS-S组应用的灌胃溶液含0.3％枸橼酸西地那非25mg/kg，其余各组灌入等容量生理盐水(8.33ml/kg)。低氧结束后，行血动力学检测、肺血管结构重塑指标检测、右室肥大指标检测、Hct检测，并行肺组织eNOS Westemblot检测及cGMP和NO含量测定。 研究结果： 1、第一部分： (1)AdCMVceNOS病毒DNA经脂质体法成功导入293细胞内，并包装成完整的病毒颗粒。经PCR鉴定并确认，扩增后检测滴度为1.58×10<'10>PFU/ml。 (2)Ad-eNOS组各检测时间点肺组织eNOS蛋白、cGMP和NO含量均明显高于C和Ad-LacZ组(p<0.01)。免疫组化显示，eNOS转基因表达分布于支气管上皮、肺泡细胞以及肺中、小血管内皮。C和Ad-LacZ组各检测时间点，肺组织eNOS蛋白、cGMP和NO含量无统计学差异(p>0.05)，仅在肺内大血管内皮有内源性eNOS蛋白表达； (3) 经气道注入重组腺病毒5天后，Ad-LacZ组大鼠肝、脾、肾脏未见外源LacZ基因表达。但有一只肺组织出现广泛炎细胞浸润。 (4) 转基因后同一检测时间点，三组大鼠体重(WT)、HR和SAP无明显差异(p>0.05)。 2、第二部分： (1)大鼠急性低氧30min后，H-eNOS和H-S组MPAP明显低于H和H-LacZ组(p<0.01)，明显高于H-eNOS-S组和N组(p<0.01)，H-eNOS-S和N组间无统计学差异(p>0.05)。 (2) 各低氧组SAP、PaO<,2>和PaCO<,2>明显低于N组(p<0.05)，HR明显高于N组(p<0.05)，且各低氧组间无统计学差异(p>0.05)。 (3) N组大鼠肺组织NO含量，明显高于H、H-LacZ和H-S组，明显低于H-eNOS和H-eNOS-S组(p<0.05)，且H、H-LacZ和H-S组间以及H-eNOS和H-eNOS-S组间无统计学差异(p>0.05)。 (4)H和H-LacZ组大鼠肺组织cGMP含量明显低于N组(p<0.05)，H-eNOS和H-S组明显高于N组(p<0.05)，且明显低于H-eNOS-S组(p<0.01)。 3、第三部分： (1) 各低氧组大鼠体重明显低于N组(p<0.01)，肺脏重量/体重比明显高于N组(p<0.05)。所有大鼠HR、SAP、肝脏重量/体重比和肾脏重量/体重比无统计学差异(p>0.05)。 (2)低氧各组大鼠MPAP、肺小血管肌化指标(CMA/MA)和右室肥厚指标(RV/(Lv+s))均明显高于N组(p<0.01)，H-eNOS与H-S组明显低于H与H-LacZ组(p<0.01)，明显高于H-eNOS-S组(p<0.05)。H与H-LacZ组间及H-eNOS与H-S组间无统计学差异(p>0.05)。 (3) H-eNOS、H-S和H-eNOS-S组Hct明显高于N组(p<0.05)，明显低于H和H-LacZ组(p<0.05)。 (4)H、H-LacZ和H-S组大鼠，肺组织eNOS蛋白含量明显高于N组(p<0.01)，明显低于H-eNOS和H-eNOS-S组(p<0.01)。 (5) N组大鼠，肺组织NO含量明显高于H、H-LacZ和H-S组(p<0.05)，明显低于H-eNOS和H-eNOS-S组(p<0.01)。 (6) H-eNOS-S组大鼠，肺组织cGMP含量明显高于其它各组(p<0.01)，N、H和H-LacZ组大鼠无明显差别(p>0.05)，明显低于H-eNOS和H-S组(p<0.01)。 研究结论： 1、重组腺病毒可介导eNOS基因在大鼠气道高效表达，转基因表达分布广泛(于支气管上皮和肺泡细胞，肺内中、小血管内皮亦有转基因表达)，靶向性高，并至少持续17天。外源eNOS基因的表达，可使肺组织NO和cGMP产量明显增高。 2、经气道转移重组腺病毒，对大鼠生命体征无影响，但有引发机体免疫反应的可能，故应在达到疗效的同时，尽量控制病毒转移的量或滴度。 3、急性低氧30min，可降低大鼠SAP，提高HR，并引发HPV，此病理过程与低氧引起肺组织NO/cGMP含量降低有关。 4、慢性低氧二周，可导致大鼠MPAP升高、肺血管结构重塑、右室肥厚和Hct上升，伴肺组织内eNOS表达上调、NO含量降低，而cGMP浓度基本不变。 5、经气道吸入AdCMVceNOS和口服西地那非，可增加肺组织内cGMP含量，减轻大鼠急性HPV和慢性低氧引起的MPAP升高、肺血管结构重塑、右室肥厚及Hct升高。二者联合应用，具有协同作用，但不能完全阻止CHPH的病理过程。

目录

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中文论著摘要

英文论著摘要

英文缩略语

前言

实验一携带人类eNOS基因的重组腺病毒的制备及在大鼠呼吸道的表达

前 言

实验材料

实验方法

结果

讨 论

结 论

实验二eNOS基因转移联合西地那非对大鼠急性低氧性肺血管收缩的影响

前 言

实验材料

实验方法

结果

讨 论

结 论

实验三eNOS基因转移联合西地那非对大鼠慢性低氧性肺动脉高压的预防作用

前 言

实验材料

实验方法

结果

讨 论

结 论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 肺动脉高压转基因治疗的研究进展

在学期间科研成绩

致 谢

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