PI3K/Akt信号通路在不同病程糖尿病大鼠心肌缺血预处理中的调控作用

摘要

本实验应用链脲佐菌素建立实验性糖尿病大鼠模型(分为糖尿病1周组和糖尿病9周组)，通过结扎大鼠左冠状动脉前降支模拟在体心肌缺血/再灌注模型和心肌缺血预处理模型，利用此模型评价心肌IPC对不同病程糖尿病大鼠再灌注损伤性心肌的影响，利用分子生物学技术观察心肌组织Akt及其信号下游的蛋白表达情况，探讨PI3K/Akt信号转导通路在不同病程糖尿病心肌IPC中的调控作用，同时深入探讨胰岛素对糖尿病大鼠再灌注损伤性心肌的保护作用及其可能的机制。 研究方法： 1、心肌缺血预处理对不同病程糖尿病大鼠再灌注损伤性心肌的影响经尾静脉注射链脲佐菌素溶液(45 mg/kg)复制实验性糖尿病大鼠模型，分别饲养1周和9周后，随机分为9组，即非糖尿病假手术组(CS)、非糖尿病缺血/再灌注组(CIR)、非糖尿病缺血预处理组(CIP)、糖尿病1周假手术组(1wS)、糖尿病1周缺血/再灌注组(1wIR)、糖尿病1周缺血预处理组(1wIP)、糖尿病9周假手术组(9wS)、糖尿病9周缺血/再灌注组(9wIR)和糖尿病9周缺血预处理组(9wIP)。假手术组给予左冠状动脉前降支穿线而不结扎，缺血/再灌注组给予结扎左冠状动脉前降支模拟缺血30 min/再灌注60 min，缺血预处理组给予缺血5 min/再灌注5 min，3个循环。每组实验结束检测血糖、血清心肌酶，心律失常评分，观察心肌组织病理形态学变化和心肌组织超微结构变化，统计心肌梗死面积百分比。 2、PI3K/Akt信号通路在不同病程糖尿病大鼠心肌缺血预处理中的调控作用实验分组同前，实验结束点在再灌注15 min，免疫组织化学方法观察P—Akt在心肌组织表达情况，利用Western blotting免疫印迹法技术，对于磷酸化Akt、磷酸化Bad、Bcl-2和Bax活性进行半定量分析。 3、胰岛素对糖尿病大鼠心肌再灌注性损伤的干预作用及其信号转导机制以实验性糖尿病9周大鼠模型和非糖尿病大鼠为实验研究对象，随机分为6组，即非糖尿病对照组、非糖尿病胰岛素组、非糖尿病胰岛素+渥曼青霉素组、糖尿病对照组、糖尿病胰岛素组、糖尿病胰岛素+渥曼青霉素组。各实验组均给予缺血30 min和再灌注60 min处理，其中胰岛素组静脉输注胰岛素4 ml/kg/h(60 u/1)；胰岛素+渥曼青霉素组静脉输注胰岛素+渥曼青霉素(1 ug/kg/h)。实验检测指标同前。 研究结果： 1、糖尿病血糖和心脏相对重量变化 经过糖尿病1周和糖尿病9周后，血糖水平明显增加至21.75 mmol/L±4.82mmol/L和27.76 mmol/L±4.68 mmol/L，与非糖尿病对照组4.89 mmol／L±0.49mmol/L比较有统计学意义(P<0.05)。糖尿病1周心脏相对重量较非糖尿病组比较无显著差别(2.64 mg/g±0.11 mg/g vs 2.54 mg/g±0.18 mg/g，P>0.05)，而糖尿病9周较非糖尿病组增加(3.44 mg/g±0.30 mg/g vs 2.54 mg/g±0.18 mg/g，P<0.05)。 2、心肌缺血预处理对非糖尿病大鼠再灌注损伤性心肌的影响 与CIR组比较，CIP组的血清CK和CK-MB降低(2441.1 U/L±280.3 U/L vs5367.0 U/L±357.4 U/L，1407.4 U/L±222.0 U/L vs 3441.4 U/L±324.1 U/L，均P<0.05)；CIP组心律失常评分降低(1.75±0.71 vs 4.25±0.89，P<0.05)；CIP组心肌梗死面积降低(31.0％±7.5％vs 58.5％±8.3％，P<0.05)；心肌组织超微结构损伤减轻；Western blotting免疫印迹显示CIP组心肌组织磷酸化Akt蛋白表达增强，同时磷酸化Bad和Bcl-2蛋白表达相应增强，Bax蛋白表达相应降低。 3、心肌缺血预处理对糖尿病1周大鼠再灌注损伤性心肌的影响 与1wlR组比较，1wlP组的血清CK和CK-MB明显降低(2519.1 U/L±273.9U/L vs 3366.1 U/L+385.4 U/L，1503/4 U/L±276.9 U/L vs 1929.4 U/L±276.0 U/L，均P<0.05)；1wlP组心律失常评分与1wlR组比较无显著差别(2.25±0.71 VS2.88±1.23，P>0.05)；1wlP组心肌梗死面积明显降低(36.8％±8.3％VS45.8％±8.7％，P<0.05)；心肌组织超微结构损伤减轻；Western blotting免疫印迹显示1wIP组心肌组织磷酸化Akt蛋白表达增强，同时磷酸化Bad和Bcl-2蛋白表达相应增强，Bax蛋白表达相应降低。 4、心肌缺血预处理对糖尿病9周大鼠再灌注损伤性心肌的影响 与9wlR组比较，9wIP组的血清CK和CK-MB增加(7682.8 U/L±361.1 U/L vs6772.2 U/L±129.2 U/L，4710.2 U/L±327.4 U/L vs 3564.0 U/L±170.6 U/L，均P<0.05)；9wIP组心律失常评分与9wIR组比较无显著差别(4.74±1.04 VS4.63±0.92，P>0.05)；9wIP组心肌梗死面积与9wIR组比较无显著差别(65.6％±7.4％vs 62.1％±8.8％，P>0.05)；心肌组织超微结构损伤加重；Westernblotting免疫印迹显示9wlP组心肌组织磷酸化Akt蛋白表达与9wIR组比较轻度增加，同时磷酸化Bad蛋白表达相应增加， Bcl-2和Bax蛋白表达无明显差异。 5、糖尿病1周心肌缺血预处理和糖尿病9周心肌缺血预处理之间比较 与1wIP组比较，9wIP组的血清CK和CK-MB明显增加(7682.8 U/L±361.1U/Lvs 2519.1 U/L±273.9 U/L，4710.2 U/L±327.4 U/LVS 1503.4 U/L±276.9 U/L，均P<0.05)；9wIP组心律失常评分较1wIP组增加(4.74±1.04 vs 2.25±0.71，P<0.051；9wIP组心肌梗死面积明显增加(65.6％±7.4％vs 36.8％±8.3％，P<0.05)；心肌组织超微结构损伤更严重；Western blotting免疫印迹显示9wIP组心肌组织磷酸化Akt蛋白表达低于1wlP组，同时磷酸化Bad和Bcl-2蛋白表达低于1wIP组，Bax蛋白表达高于1wIP组。 6、胰岛素对非糖尿病大鼠再灌注损伤性心肌的保护作用 与非糖尿病对照组比较，胰岛素组可以使血清CK和CK-MB明显降低(2652-3U/L±243.2 U/L vs 5380.1 U/L±292.4 U/L，1399.9 U/L+83.8 U/L VS 2720.3U/L+160.8 U/L，均P<0.05)；胰岛素组心律失常评分明显降低(1.87±0.64 vs3.88±1.13，P<0.05)；胰岛素组心肌梗死面积明显降低(32.7％±5.6％vs44.8％±7.2％，P<0.05)；心肌组织超微结构损伤减轻；Western blotting免疫印迹显示胰岛素组心肌组织磷酸化Akt蛋白表达高于对照组，同时磷酸化Bad和Bcl-2蛋白表达相应增强，Bax蛋白表达相应低于对照组。胰岛素的这种心脏保护作用可以被渥曼青霉素取消。 7、胰岛素对糖尿病9周大鼠再灌注损伤性心肌的保护作用 与糖尿病对照组比较，胰岛素组可以使血清CK和CK-MB明显降低(3363.0U/L±192.7 U/L vs 6571.3 U/L±430.6 U/L，1893.6 U/L±192.7 U/L vs 3463.5U/L±249.1 U/L，均P<0.05)；胰岛素组心律失常评分明显降低(2.13±0.87 vs4.25±1.28，P<0.05)；胰岛素组心肌梗死面积明显降低(41.8％±6.5％vs55.3％±9.3％，P<0.05)；心肌组织超微结构损伤减轻；Western blotting免疫印迹显示胰岛素组心肌组织磷酸化Akt蛋白表达高于对照组，同时磷酸化Bad和Bcl-2蛋白表达相应增强，Bax蛋白表达相应低于对照组。胰岛素的这种心脏保护作用可以被渥曼青霉素取消。 研究结论： (1)IPC可以显著减轻非糖尿病大鼠再灌注性心律失常的严重程度，降低升高的血清心肌酶，缩小心肌梗死面积，保护心肌组织形态学结构；IPC对于糖尿病1周大鼠心肌具有同样的心脏保护作用；IPC的心脏保护作用对糖尿病9周大鼠作用不明显。 (2)PI3K/Akt信号转导通路参与IPC的心脏保护作用，可通过激活Akt磷酸化表达，进而影响前凋亡基因Bad、抗凋亡基因Bcl-2和凋亡基因Bax表达，从而发挥抗心肌凋亡作用。 (3)随着糖尿病病程的进展，糖尿病心肌组织的Akt表达存在一定的缺陷；糖尿病心肌Akt不同程度的激活部分参与了IPC对不同病程糖尿病再灌注损伤性心肌的作用。 (4)胰岛素对于非糖尿病再灌注损伤性心肌具有保护作用，主要是通过PI3K/Akt信号转导途径，激活Akt，影响该信号下游的Bcl-2家族蛋白的表达，达到抗心肌细胞凋亡、保护心肌的作用。 (5)胰岛素对于慢性糖尿病再灌注损伤性心肌同样具有保护作用，但保护作用效果弱于非糖尿病心肌。

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英文缩略语

论文一 心肌缺血预处理对不同病程糖尿病大鼠再灌注损伤性心肌的影响

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 PI3K/Akt信号通路在不同病程糖尿病大鼠心肌缺血预处理中的调控作用

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三 胰岛素对糖尿病大鼠心肌再灌注性损伤的干预作用及其信号转导机制

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 糖尿病心肌缺血预处理的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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