不同遗传背景小鼠冻融精子体外受精及单精注射的研究

摘要

对不同遗传背景小鼠的超数排卵效果和体外受精率进行比较研究，以探索建立不同遗传背景小鼠资源冷冻胚胎库的方法。选用35个不同遗传背景的小鼠品系(其中：7个近交系、3个同类系、3个封闭群、22个突变系)分别进行超排和体外受精，观察其超排数、异常卵率及体外受精率。结果显示各品系小鼠的平均超排卵数在11.8～38.7个之间；异常卵率为0.2～32.2％；体外受精率15.2％～97.2％．证明不同遗传背景的小鼠超排卵数、异常卵率及体外受精率差异显著(P<0.05)。 为分析影响小鼠精子冷冻成功的因素。用含3％脱脂奶和18％棉子糖的冷冻保护剂分别冷冻C57BL/6J，FVB/NJ，B6D2F1，KM和ICR小鼠精子。复苏后，评价小鼠精子的冷冻效果和受精能力。结果各品系小鼠精子冷冻前后的受精率不同；新鲜精子体外受精时，C57BL/6J、FVB/NJ、B6D2F1，KM和ICR五个品系的小鼠的受精率分别为81.4％、87.2％、90.4％、82.7％和79.4％而冻融精子的体外受精率分别为6.7％、46.0％、76.8％、59.2％和31.9％，差异极显著(P<0.01)。实验表明遗传背景不同的小鼠品系，精子的受精能力及对冷冻的耐受能力不同。 近交系小鼠C57BL/6J及以C57BL/6J为背景的转基因小鼠冻融精子的体外受精率低，不足10％，是国内外研究者共同面临的困难。本研究中，使用两种不同的冷冻保护剂，本实验室自制的R18S3与商品化的FERTIUP<'TM>分别冷冻小鼠精子；并且采取两种不同的冻存方式传统大麦杆法和三角形提杆法进行冷冻精子的保存。分别比较以下四种冷冻方法对C57BL/6J，LAP/rtTA(以C57BL/6J为背景的转基因小鼠)和DBA/2三个品系小鼠精子的冷冻效果。方法1：R18S3+传统大麦杆冻存；方法2：CPA-FERTIUP<'TM>+传统大麦杆冻存；方法3：R18S3+三角形提杆冻存；方法4：CPA-FERTIUP<'TM>+三角形提杆冻存。通过小鼠冻融精子受精率的高低，来探讨冻存方式对小鼠冻融精子受精率的影响及不同冷冻保护剂对精子的保护效果。当C57BL/6J，LAP/rtTA和DBA/2三个品系小鼠精子经方法2(CPA-FERTIUP<'TM>冷冻+传统大麦杆冻存)和方法4(CPA-FERTIUP<'TM>冷冻+三角形提杆)冻存后同方法1和方法3相比，体外受精率显著提高(C57BL/6J，20.7％vs7.5％和29.3％vs6.6％；LAP/rtTA，44.4％vs10.6％和46.2％vs11.1％；DBA/2，90.5％vs75.8％和92.4vs66.1％)。结论表明，用(2PA-FERTIUP<'TM>冷冻小鼠精子，复苏后精子的体外受精率得到显著提高。 利用piezo操作系统，分析小鼠精子头和尾激活卵母细胞的能力，然后进行近交系小鼠C57BL/6J和封闭群小鼠ICR冻融精子ICSI和IVF的比较研究。实验结果表明1、精子尾不具有激活卵母细胞的能力；2、Piezo操作系统ICSI时对近交系小鼠卵膜的损伤较大，卵子存活率低于封闭群(41％vs49％)； 3、近交系小鼠C57BL/6J冻融精子的受精率可以通过ICSI明显提高(同IVF结果相比分别为94％和8％，P<0.01)。4、C57BL/6J小鼠冻融精子ICSI和IVF的囊胚发育率低于ICR(39％，40％vs 53％，54％)。

目录

论文说明：缩略语表

声明

摘要

前言

综述一、实验小鼠资源低温冷冻保存的研究进展

综述二、小鼠单精注射的研究进展

综述三、影响ICSI受精率的相关因素

第一章不同遗传背景小鼠的超排与体外受精率的比较研究

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1各品系小鼠的超排卵数、异常卵数及体外受精结果

2.2各品系小鼠超排效果的比较

2.3小鼠早期胚胎的形态学评价

2.4各品系小鼠体外受精率的比较

3.讨论

第二章影响小鼠冻融精子体外受精率的主要因素探讨

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1各品系小鼠的新鲜精子浓度

2.2各品系小鼠冷冻前后活率和活力的分析

2.3各品系小鼠新鲜精子和冷冻精子体外受精率的比较

2.4体外受精后的胚胎培养

3.讨论

第三章两种不同冷冻保护剂及冻存方式对小鼠精子冷冻效果的比较

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1两种冷冻保护剂R18S3和CPA-FERTIUPTM冷冻效果的比较

2.2两种冻存方式传统大麦杆法和三角形提杆法冷冻后体外受精率的比较

2.3着床前胚胎发育率的比较

2.4着床后胚胎发育率的比较

3.讨论

第四章小鼠冻融精子ICSI和IVF的比较研究

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果

2.1小鼠精子头和精子尾激活卵母细胞的能力

2.2 C57BL/6J和ICR冻融精子ICSI和IVF受精率及胚胎发育率的比较

3.讨论

结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文