干扰素-α对PDGF-BB刺激肝星状细胞分泌ECM及TGF-β表达影响的研究

摘要

目的：肝纤维化是多种病因导致慢性肝病共有的病理改变，肝纤维化的显著特征是细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的增加和成分的改变。目前研究表明，肝星状细胞(HSC)的活化和增殖是肝纤维化形成的关键和中心环节。HSC具有生成ECM，分泌细胞因子以及收缩等多种功能，在肝硬化、门静脉高压症的发生发展中起了关键性的作用[4-6]。近年来的研究表明，细胞因子在肝纤维化形成中发挥重要的作用，以转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的促纤维化生成作用最强；血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)作为HSC的强有力的促有丝分裂原，可促进HSC分裂、增殖和活化静息状态的HSC激活为成纤维母细胞合成大量ECM，在肝纤维化形成和发展过程中起着重要的作用。ECM包括胶原、非胶原糖蛋白以及蛋白聚糖，主要以胶原为主。正常情况下HSC分泌的胶原以Ⅲ、Ⅳ型胶原为主，仅合成少量的Ⅰ型胶原。在肝脏损伤时，HSC被激活，合成大量的以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的ECM。Ⅰ型胶原可促进HSC激活、增殖，并抑制肝细胞及窦内皮细胞的增生，促进肝纤维化的发展。目前干扰素-α(IFN-α)作为抗病毒的药物已应用于肝炎的临床治疗中。但对于IFN-α的抗肝纤维化的机制尚不完全清楚。本研究通过观察IFN-α对于PDGF-BB刺激体外培养的HSC分泌Ⅰ型胶原(Col-I)及TGF-β1表达的影响，以期阐述IFN-α抗肝纤维化的部分作用机制，为临床肝纤维化的药物治疗提供更多的理论依据。 材料与方法： 一、实验材料 1、大鼠肝星状细胞株(r-HSC99)中国医科大学附属盛京医院感染科研究室提供。 2、主要试剂 重组人干扰素-α 2b(IFN-α 2b)(Prospec公司)；血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)(Peprotech Asia公司)；MTT(武汉博士德生物公司)；DMEM高糖培养液、胎牛血清(美国Gibco公司产品)；琼脂糖(Sigma公司)；酶标仪(Labsystems Dragon公司)；Trizol RNA提取试剂盒(Invitrogin公司)；RT-PCR试剂盒、β-actin引物、Ⅰ型胶原(Col-I)引物、转化生长因子β1(TGF-β1)引物(大连宝生物工程有限公司)；DNAmarker(MBI公司)。 二、实验方法 体外培养大鼠肝星状细胞系rHSC-99，分别用不同浓度的IFN-α、PDGF-BB干预和两者共同干预，用四甲基偶氮唑蓝实验(MTT)观察各组对HSC增殖的影响，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定各组对HSC细胞Col-ImRNA和TGF-β1mRNA表达的影响。 三、统计学处理 应用SPSSV13.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示，各组之间是否存在显著性差异分析采用One-way ANOVA分析，LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。 实验结果： 1、MTT检测结果分别用不同浓度的IFN-α(0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125ng/ml)，20ng/mlPDGF-BB及不同浓度的IFN-α(0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125ng/ml)+20ng/mlPDGF-BB作用于HSC，并设对照组，应用MTT法检测吸光度值(A值)，经方差分析，20ng/mlPDGF-BB组及(0.4、0.2、0.1、0.05ng/ml)IFN-α+PDGF-BB五组与对照组的A值比较均有显著性差异，均P<0.05有统计学意义，其他干预组无显著性差异。PDGF-BB组较对照组A值高，(0.4、0.2、0.1、0.05ng/ml)IFN-α+PDGF-BB四组A值均较对照组A值低，说明PDGF-BB可促进HSC的增殖，单独IFN-α干预对HSC的增殖无明显的抑制作用，但IFN-α与PDGF-BB共同作用可明显抑制HSC的增殖，且在0.025ng/ml-0.1ng/ml范围内能呈剂量依赖性抑制HSC的增殖。 2、RT-PCR检测结果不同干预组作用于HSC，分别作用12h、24h、48h、72h后，对Col-I及TGF-β1基因表达的影响：用RT-PCR检测Col-I及TGF-β1基因相对表达值，各时间点PDGF-BB(20ng/ml)组Col-I，TGF-β1基因表达水平均较正常对照组明显增高，经方差分析，差异均有统计学意义(P<0.05)；四个时间点，(0.2、0.1、0.05 ng/ml)IFN-α+PDGF-BB三组Col-I，TGF-β1基因表达水平均较对照组有降低，经方差分析，四个时间点的上述三个干预组与相应的对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，且随着IFN-α浓度的增加及时间的延长差异越显著；其他干预组与对照组比较，差异无统计学意义。表明PDGF-BB增强HSC的Col-ImRNA和TGFβ1mRNA表达，IFN-α单独干预对HSC的Col-ImRNA和TGF-β1mRNA表达无明显影响，但IFN-α,与PDGF-BB共同作用可明显抑制HSC Col-ImRNA和TGF-β1mRNA表达，并呈量效及时间依赖关系。 结论： 1、PDGF-BB可明显促进HSC的增殖，促进Col-I及TGF-β1基因的表达； 2、单独IFN-α干预对HSC的增殖和Col-I、TGF-β1基因的表达无明显的影响； 3、IFN-α对PDGF-BB诱导的HSC的增殖及Col-I、TGF-β1基因的表达有明显的抑制作用，并呈量效及时间依赖关系。

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综述干扰素治疗肝纤维化机制的研究进展

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