TNF-α增强肝肾综合征肾血管收缩机制的研究

摘要

目的:
　　肝肾综合征(HRS)的病理生理标志是肾血管收缩，进而导致肾皮质血流量减少，肾小球滤过率(GFR)下降。GFR的大小决定于有效滤过压和滤过系数，而肾血管收缩是引起有效滤过压降低的决定因素。肾入球动脉平滑肌细胞(RASMCs)的功能状态直接影响肾入球小动脉的舒缩，胞浆游离Ca2+浓度([Ca2+]i)升高与RASMCs收缩密切相关，由于RASMCs对许多缩血管活性物质（如儿茶酚胺、血管紧张素Ⅱ、血管加压素、血栓素A2、内皮素、白三烯等）均敏感，当接受这些物质刺激时，[Ca2+]i会明显升高，引起细胞收缩。1，4，5-三磷酸肌醇受体(IP3R)是细胞内重要的Ca2+释放通道，因此RASMCs中IP3R表达量的多少影响其对缩血管物质的敏感性。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与重症感染时肾衰的发生发展密切相关，HRS发生时血中TNF-α水平也明显升高，有文献指出TNF-α可间接参与平滑肌细胞的收缩。TNF-α可否影响IP3R表达进而参与RASMCs收缩引起的肾血流减少尚不清楚。本研究应用离体灌注肾技术(IPKT)从器官水平观察TNF-α预灌流后离体大鼠肾血管对ET收缩反应性的改变;应用原代培养的RASMCs，从细胞水平观察TNF-α对[Ca2+]i及细胞收缩程度的影响;并从分子水平探讨其可能机制，即TNF-α对RASMCs内Ⅰ型IP3R蛋白、mRNA表达及其启动子活性的影响，揭示TNF-α在HRS发生发展中的作用。
　　方法:
　　1、离体灌注肾实验模型的建立
　　应用戊巴比妥钠(30 mg/Kg体重)经腹腔注射将大鼠麻醉。剪毛，腹壁消毒，正中切开，分离肠系膜上动脉、右肾动脉、右肾静脉及右侧输尿管。用套管针从肠系膜上动脉插管，经腹主动脉，插入右肾动脉起始部，管外接三通，三通接张力换能器和灌注装置，肾静脉开放，在肠系膜上动脉及右肾动脉主干分别结扎。左肾取出称重作为对照肾重。灌注过程:在腹主动脉插管至肾动脉时启动灌注泵，开始灌流。灌注液流量恒定为5 ml/min，经热交换器加温至37℃，经氧合器持续给95％氧和5％二氧化碳的混合气，灌注液为一次性，不再循环应用。
　　2、观察TNF-α对ET收缩肾血管强度的影响
　　28只SD大鼠随机分为4组(n=7)，应用离体灌注肾技术(IPKT)灌流离体大鼠肾脏，并测定肾血管灌注压。
　　分组:A1组无钙Kreb's液预灌流+ET刺激;
　　A2组(TNF-α+无钙Kreb's液)预灌流+ET刺激;
　　B1组(无钙Kreb's液+2-APB)预灌流+ET刺激;
　　B2组(TNF-α+无钙Kreb's液+2-APB)预灌流+ET刺激。
　　3、原代大鼠RASMCs分离与培养
　　麻醉大鼠，开腹，于左肾动脉穿刺插管，用含6％BSA的冷PSS灌注至肾脏变白，留取皮质，经180μM的筛网挤压过滤，将筛网上存留的血管组织经酶消化20min，经70μm的筛网过滤，再次经酶消化15min，原代分离大鼠RASMCs，于20％FCS的DMEM培养液、37℃、5％CO2培养箱中培养，细胞生长至单层融合后常规传代。观察细胞生长情况，经间接免疫荧光抗平滑肌α-肌动蛋白抗体、抗平滑肌肌球蛋白重链单克隆抗体染色阳性、透射电镜观察到微丝鉴定为RASMCs。取3-10代细胞用于实验。
　　4、观察TNF-α对胞内[Ca2+]i的影响
　　应用Fluo-3/AM荧光标记技术及confocol共聚焦显微镜检测单个细胞内[Ca2+]i动态变化。分组:TNF-α处理0h+ET刺激组和TNF-α处理24h+ET刺激组;2-氨基乙基二苯硼酸盐(2-APB)+ ET刺激组和TNF-α+2-APB+ET刺激组。
　　5、观察TNF-α对RASMCs收缩敏感性的影响
　　通过测量RASMCs收缩前、后的表面积得出细胞收缩的幅度。分组同测钙组。
　　6、检测TNF-α对RASMCsⅠ型IP3R蛋白及mRNA表达的影响
　　应用Western blot、Real-time quantitative PCR方法，检测TNF-α处理后 RASMCs内Ⅰ型IP3R蛋白及mRNA的表达。分组:TNF-α处理0h、4h、8h、24h组;
　　7、TNF-α对Ⅰ型IP3R启动子活性的影响
　　将重组质粒PGL3-IP3RI promoter转染RASMCs，通过检测萤火虫荧光素酶(luc)报告基因的表达活性，说明TNF-α对Ⅰ型IP3R启动子活性的影响。分组:TNF-α处理0h、4h、8h、24h组。
　　结果:
　　1、大鼠离体肾体外灌注结果
　　平衡期过后，当分别将TNF-α、2-APB加入灌注液中进行预灌流时，灌注压仍保持在基础灌注压水平，无明显改变。A1及A2组ET刺激后肾灌注压较基础灌注压明显升高(t=2.779，P=0.016;t=5.689，P=0.000)，且A2组灌注压增高值与A1组相比具有显著性差异(t=3.319，P=0.006);B1及B2组ET刺激后肾灌注压无明显改变。
　　2、RASMCs内[Ca2+]i测量结果
　　Fluo-3/AM标记后显示，内皮素(ET)刺激可使RASMCs胞内[Ca2+]i在短时间内迅速、显著的增加。TNF-α处理24h后上述效应明显增强，[Ca2+]i上升幅度与0h组相比有显著性差异(t=5.335，P=0.000)。且上述效应可被2-APB完全阻断。
　　3、RASMCs表面积测量结果
　　TNF-α处理0h组加入ET约1min时，即出现可见的细胞收缩变化;3min时细胞形态变化最为明显，细胞面积明显缩小。TNF-α处理24h后上述效应明显增强，细胞面积缩小的更加明显，与前者相比差异显著(t=6.641，P=0.000)。
　　4、Western blot半定量分析RASMCsⅠ型IP3R蛋白的表达
　　0h组RASMCs内Ⅰ型IP3R表达水平较低，TNF-α处理4h～24h组Ⅰ型IP3R蛋白的表达明显增高，以24h最为明显，与0h组比较均有显著差异(4h: P=0.039;8h: P=0.01;24h: P=0.003)。
　　5、实时定量PCR检测RASMCsⅠ型IP3R mRNA表达
　　TNF-α处理4h～24h组RASMCs内Ⅰ型IP3R mRNA的表达明显增高，以TNF-α处理8h时最为明显，与0h组比较差异显著(4h: P0.049;8h: P=0.002;24h:P=0.011)。
　　6、RASMCs内Ⅰ型IP3R启动子活性检测
　　在0h组RASMCs内，Ⅰ型IP3R启动子活性很弱;TNF-α处理4h～24h组，Ⅰ型IP3R启动子活性增强，以TNF-α处理8h最为明显，与0h组相比有显著性差异(4h: P=0.046;8h: P=0.001;24h: P=0.017)。
　　结论:
　　1、TNF-α可增强ET引起的肾血管收缩，且通过IP3R发挥作用;
　　2、TNF-α可增强ET引起的胞内钙释放，进而增强RASMCs收缩，且通过IP3R发挥作用;
　　3、TNF-α能上调Ⅰ型IP3R蛋白与mRNA表达，且最初作用于Ⅰ型IP3R启动子。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 TNF-α对肾血管收缩敏感性的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文二 TNF-α对肾入球动脉平滑肌细胞收缩及胞内钙离子浓度的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文三 TNF-α对肾入球动脉平滑肌细胞Ⅰ型IP3R表达的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新点自我评价

参考文献

综述 肝肾综合征肾血管收缩机制

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