丹参酮ⅡA对小鼠脑血管内皮细胞内皮素系统的影响

摘要

脑的微循环障碍，血脑屏障的破坏是脑水肿的重要机制，内皮素(ET)是迄今为止所知的最强的长效缩血管物质，它参与了脑水肿的发生，发展的过程，它促进了血脑屏障的破坏。所以以内皮素为作用靶点，改善脑创伤后脑血流动力学，减少血管痉挛，保护血管调节功能应是临床脑水肿治疗的重要方法之一，中药丹参作为活血化瘀药物已经广为人熟知，它能够保护脑血管内皮细胞，维护血脑屏障，促进微循环，它们已广泛用于临床各种类型脑水肿的治疗，临床上已得到比较确定的疗效，但基础实验有关其疗效及其具体保护血脑屏障机制的研究还较少，本实验观察了在常规甘露醇治疗的基础上结合使用丹参酮IIA对大鼠冷冻所致脑水肿的影响。在此基础上，通过TNF-α诱导小鼠脑血管内皮细胞产生ET-1，通过该模型进而探讨丹参酮IIA对内皮素系统的影响，从而进一步阐明丹参酮IIA作用脑血管的机制。 方法： 第一部分：(1)wistar成年大鼠80只，雌雄不限，随机分为4组，A(正常对照组)：未冷冻未治疗。给予生理盐水腹腔注射10ml/kg；B：(手术对照组)，冷冻后未进行任何治疗：每天予生理盐水腹腔注射10ml/kg；C：(甘露醇治疗组)，大鼠尾静脉滴注20％甘露醇10ml/kg；D(甘露醇+丹参酮IIA治疗组)，在同C组相同的治疗方案基础上每24小时分给予尾静脉注射丹参酮IIA注射液25mg/kg;(2)脑水肿模型：wistar成年大鼠，用直径圆形铜探针置于硬膜上，液氮冷冻60s，制成脑水肿模型。(3)神经功能评分：所有大鼠治疗24小时,48小时,72小时，一周后行神经功能缺损观察，采用改良的Zea-Longa量表进行评分。(4)光镜及电镜观察：于冷冻灶周边取1mm的脑片，置入固定液中，送透射电子显微镜室观察标本的超微结构。(5)脑含水量测定：每组分别于24小时，48小时,72小时，一周后随机取6只断头处死，开颅取脑,用滤纸轻吸去表面水分，装于精称过的称量瓶中，标记并称湿重，置烘箱105℃烘至恒重，两次称量差不超过0.0006g,干湿法测定组织含水量，按Eiliott公式计算脑含水量。脑含水量(％)：(湿重-干重)/湿重×100％(6)甲酰胺法测定EB含量：采用改进Young氏改良法提取大鼠左右半球干脑组织的伊文氏蓝，然后在分光光度仪上测定含量。右半球伊文氏蓝增量=右半球伊文氏蓝量-左半球伊文氏蓝量。 第二部分：(1)大鼠冷冻后72小时后，眼底取血4ml，肝素钠抗凝，送辽宁省中医学院药理实验室，用FASCOW全自动血液流变检测仪检测。(2)内皮素含量测定：采用放射免方法(RIA)，各组分别于24小时,48小时,72小时，一周后，用玻璃毛细管眼底取血，加入10％EDTA二钠30ul和抑肽酶40ul，混匀，采用非平衡法按试剂盒说明书操作计算血浆内皮素含量。 第三部分：(1)细胞毒性测定MTT法测定：各组分别取细胞悬液加入MTT溶液(MTT 5mg/ml)20μl，充分溶解于DMSO，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，取平均值。按以下公式计算细胞存活率：细胞存活率=实验组光吸收OD值/对照组光吸收OD值×100％。(2)培养液ET,大ET测定：放射免疫法测定，收集标本后根据放射免疫试剂盒有关说明进行。(3)根据有关文献设计ET-1，ECE-1,ETA,ETB引物，提取细胞RNA，测定提取总RNA的含量及纯度检测，逆转录PCR扩增，PCR产物电泳，对DNA条带进行检测和图像分析。(3)ET结合力测定细胞清洗匀浆处理后，取离心沉淀的细胞膜蛋白，投放125I-ET-1，丹参酮IIA等进行竞争抑制，测定细胞对125I-ET-1结合率，探讨丹参酮IIA是否影响ET-1和受体的结合。 结果： 第一部分：(1)各治疗组与模型组对照，神经功能缺陷评分显著降低(P<0.05或P<0.01)，神经功能均显著改善。(2)经过甘露醇，丹参酮IIA联合治疗后，血脑屏障的破坏程度减轻，神经元，内皮细胞以及都保持正常结构，紧密连接结构正常。(3)脑组织含水量和EB含量变化：各治疗组术后24小时，48小时，72小时，一周后脑组织水含量均有显著性下降(P<0.01)，结合丹参治疗组同C组相比，脑组织含水量均降低，有显著差异(P<0.01或P<0.05)。 第二部分：(1)D组血液粘度高切，低切均明显降低，与模型组有显著差异(P<0.05)，D组和C组差异无显著性(P>0.05)。(2)大鼠冻伤后血浆ET含量持续增加，较正常组明显增高，甘露醇治疗组，丹参酮IIA+甘露醇治疗组，均较模型组显著降低，其中丹参酮IIA+甘露醇治疗组降低更为明显，单独的甘露醇治疗对血浆的ET-1没有显著改变第三部分(1)丹参酮IIA．对细胞存活率的影响：不同浓度的丹参酮IIA对脑血管内皮细胞的存活率没有影响，当丹参酮IIA浓度达到10ug/ml，20ug/ml时，TNF-α(5ug/ml)作用脑血管内皮细胞时细胞存活率相比较，有显著性差异。(2)丹参酮IIA．对ET含量的影响：丹参酮IIA呈剂量依赖性降低培养液中ET含量，TNF-α使脑血管内皮细胞大ET含量明显减少，而作用丹参酮IIA后，培养液中大ET含量随着丹参酮IIA浓度的增加而升高。(3)TNF-α使脑血管内皮细胞ECE-1mRNA表达明显升高，10ug/ml.20ug/ml的丹参酮IIA使ECE-1mRNA表达明显降低。TNF-α作用脑血管内皮细胞后，其ETmRNA表达明显升高但是和单独TNF-α作用脑血管内皮细胞后相比，不同浓度丹参酮IIA处理后脑血管内皮细胞的ETmRNA的表达并没有明显变化。TNF-α明显增强脑血管内皮细胞ETAmRNA表达，但是对ETBmRNA表达呈相反的作用，当丹参酮IIA浓度达到10ug/ml，20ug/ml时，ETAmRNA表达明显降低，不同浓度的丹参酮IIA使ETBmRNA表达明显增高。(4)不同浓度丹参酮IIA作用后，脑血管内皮细胞El

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英文论著摘要

论文一丹参酮IIA对大鼠冷冻所致脑水肿的影响

前言

实验材料与方法

结果

讨论

论文二丹参酮IIA对大鼠冻伤后脑水肿血流流变学及血浆内皮素的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

论文三丹参酮IIA对TNF-α诱导小鼠脑血管内皮细胞内皮素系统的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

本研究创新性自我评价

参考文献

综述内皮素与脑创伤,脑血管痉挛

在学期间科研究成绩

致谢

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