β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素引起星形胶质细胞ERK磷酸化的信号传导途径

摘要

在脑内，肾上腺素能和去甲肾上腺素能神经元位于脑桥和延髓，分别向上和向下投射神经纤维，其支配区域相当广泛，包括大脑皮质、边缘叶、海马和脊髓。正常状态下，对维持脑的功能发挥重要作用。在病理状态时，去甲肾上腺素除了与抑郁症有关外，目前研究发现在多发性硬化病人的脑白质中，星形胶质细胞出现β-肾上腺素受体的丢失；在老年性痴呆的病人，Gs蛋白耦联受体细胞内信号传导系统、cAMP和蛋白激酶A(PKA)功能降低。 神经胶质细胞可分为星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。其中星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最为广泛的一类细胞。星形胶质细胞从胞体伸出许多长且有分支的线状伪足，并黏附在微血管周围。相邻星形胶质细胞间有缝隙连接，缝隙连接处狭窄，只允许小分子物质通过。星形胶质细胞是不可兴奋型细胞，具有支持、营养神经细胞，维持细胞外液离子平衡，构成血脑屏障及合成神经活性物质的功能，同时表达多种生物活性物质的受体，并且在免疫调节中起着重要作用。 上皮生长因子受体(EGFR)的间接激活(Transactivation)是近年来发现的细胞内/外信号传导途径，是细胞根据外界刺激调节自身功能的一种巧妙方式。G蛋白耦联受体(GPCR)激活或外界刺激，导致某种生长因子的释放，进而激活自身和相邻的酪氨酸激酶受体，产生与直接激活酪氨酸激酶(RTK)相似效应的过程。EGFR被配体激活后启动细胞内信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应等，调控细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡，并且与肿瘤的形成与恶化密切相关。 β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素(Isoproterenol)对细胞的调节具有细胞特异性。在某些细胞异丙肾上腺素能够引起上皮生长因子受体的激活，而在另一些细胞则抑制细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化；即使同样是β-肾上腺素受体激活所引起的ERK磷酸化，其信号传导通路也不尽相同。本篇文章主要研究在星形胶质细胞，(1)β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素是否引起EGFR的间接激活；(2)异丙肾上腺素引起ERK磷酸化的信号传导途径。 方法: 星形胶质细胞取材于新生CD-1小鼠大脑皮层。无菌操作，断头剥离脑膜后，取出脑组织。显微镜下分离出大脑皮层，切碎后加入培养液充分振荡1分钟。分别过100μm和70μm滤膜，放入Falcon Primaria培养皿中。用含有7.5 mM葡萄糖的DMEM培养基进行培养，每周更换两次新鲜培养液，培养三周后用于实验，实验前一周加入dBcAMP促进细胞分化成熟。首先在培养皿中加入PTX、H-89、GM6001、肝素、AG1478或PP1其中任一种抑制剂，37℃孵育15分钟。再加入异丙肾上腺素，孵育20分钟。移出培养液，应用PBS清洗细胞后，加入300μl/皿裂解液收集细胞。匀浆后的样品进行免疫凝胶电泳半定量测定ERK1/2磷酸化水平。使用SPSS 12.0软件进行统计分析，多组资料用one-way ANOVA方法进行比较，P<0.05表示差异具有统计学意义。 结果: 1、异丙肾上腺素诱导ERK的磷酸化在星形胶质细胞，异丙肾上腺素引起ERK的磷酸化。异丙肾上腺素浓度为1nM时，p-ERK1/2略有升高，而在10 nM、100 nM、1μM和10μM时，磷酸化水平显著升高，差异具有统计学意义。并且100 nM异丙肾上腺素引起的ERK磷酸化作用时间较长，10、20和40分钟后均引起了p-ERK1/2的显著增高，差异具有统计学意义。 2、Gi蛋白抑制剂的作用0.2μg/ml Gi蛋白抑制剂百日咳毒素(PTX)不能抑制由异丙肾上腺素引起的ERK磷酸化，差异具有统计学意义。表明β-肾上腺素受体激动剂引起的ERK磷酸化与Gi蛋白的βγ亚单位无关。 3、PKA抑制剂的作用5 μM PKA抑制剂H-89不能抑制由异丙肾上腺素引起的ERK磷酸化，差异具有统计学意义。表明β-肾上腺素受体激动剂介导的ERK磷酸化与PKA无关。 4、Epac诱导ERK的磷酸化在星形胶质细胞，10μM Epac1/2特异性激活剂8-pCPT-2'-O-Me-cAMP能够引起ERK的磷酸化，差异具有统计学意义。表明Epaes及其下游调节机制参与了β-肾上腺素受体激动剂介导的ERK磷酸化过程。 5、金属蛋白酶抑制剂和肝素的作用10 μM Zn2+依赖性金属蛋白酶抑制剂GM6001和1 mg/ml肝素均不能抑制由异丙肾上腺素引起的ERK磷酸化，差异具有统计学意义。表明β-肾上腺素受体激动剂引起的ERK磷酸化与金属蛋白酶无关，并且也无HB-EGF的剥离释放。 6、EGFR和Src抑制剂的作用1μM上皮生长因子受体特异性拮抗剂AG1478能够部分抑制由异丙肾上腺素引起的ERK磷酸化，而10μM Src酪氨酸激酶抑制剂PP1能够完全抑制此磷酸化过程，差异均具有统计学意义。表明异丙肾上腺素介导的ERK磷酸化，可通过Src酪氨酸激酶直接引起上皮生长因子受体激活，进而引起ERK的磷酸化；并且Src酪氨酸激酶也可能直接激活ERK。 讨论: 传统的cAMP-蛋白激酶途径是以靶细胞内cAMP浓度改变和激活PKA为主要特征。PKA被cAMP激活后，能在ATP存在的情况下使许多蛋白质特定的丝氨酸和/或苏氨酸残基磷酸化，从而调节细胞的物质代谢和基因表达。最近研究发现在哺乳动物细胞，cAMP可直接激活PKA和/或Epac1/2。Epae是一种由cAMP直接激活的交换蛋白，能够进一步激活small GTPases Rap1和Rap2。 与Gi/o和Gq蛋白耦联受体所引起的上皮生长因子受体间接激活有所不同，Gs蛋白耦联受体激活ERK的信号传导途径更为复杂。由不同的G蛋白耦联受体激活上皮生长因子受体，其生理功能可完全不同，原因可能有以下两点：1)上皮生长因子受体激活的强度及持续时间不同，Gi/o和Gq蛋白耦联受体所引起的ERK磷酸化，一般发生快，持续时间短，大约在10至20分钟达高峰，然后很快下降至消失；而cAMP引起的ERK磷酸化持续时间较长。2)配体与受体结合时，引起EGFR的二聚化作用，EGFR可以形成同型二聚体，也可以和HER2、HER3、HER4形成异型二聚体。 上皮生长因子受体间接激活的信号传导途径不仅取决于G蛋白耦联受体的种类，而且也依赖于细胞的种类。随着研究的不断深入，人们发现Gs蛋白耦联受体的激活在某些细胞，如PC12细胞，也能引起上皮生长因子受体的激活，而在另一些细胞，如成纤维瘤细胞和血管平滑肌细胞，cAMP则抑制ERK的磷酸化。即使同样是β2-肾上腺素受体激活所引起的ERK磷酸化，在COS细胞此磷酸化是由β2-肾上腺素受体的Gs蛋白转变成Gi蛋白所引起，而且不能被cAMP所替代；而在淋巴瘤细胞ERK磷酸化是通过Epae1/Rap1信号通路完成的。在星形胶质细胞情况则更为复杂，cAMP、Epae1/2、Src和EGFR可能都参与了异丙肾上腺素引起的ERK磷酸化。 结论: 在星形胶质细胞，β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素与β-肾上腺素受体结合后，催化Gs蛋白，使细胞内cAMP浓度增高，进而激活：Epacs，通过与Src酪氨酸激酶有关的途径直接引起上皮生长因子受体的激活，进一步引起ERK磷酸化；并且Src酪氨酸激酶也可能直接激活ERK。

目录

论文说明：英文缩略语

声明

中文论著摘要

英文论著摘要

前言

实验材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述：在星形胶质细胞β-肾上腺素受体的功能

在学期间科研成绩

致谢

个人简介