联合应用血管内皮生长因子与罂粟碱选择性开放血肿瘤屏障效果与机制的研究

摘要

目的
　　血脑屏障(blood-brainbarrier,BBB)可以动态调节物质在血液循环和脑组织的交换，保持脑组织内环境的稳定。虽然肿瘤血管与正常血管相比有着不同的结构和功能特征，但同样存在着血肿瘤屏障(blood-tumorbarrier,BTB)，阻止大部分抗肿瘤药物通过BTB进入肿瘤组织。研究显示如果肿瘤组织的药物浓度提高两倍，其治疗效应则增加十倍。因此有效的开放BTB将为脑胶质瘤的综合治疗提供新的希望。
　　血肿瘤屏障通透性是由紧密连接(tightjunction，TJ)控制的细胞旁途径和caveolae介导的跨细胞途径的通透性决定的。紧密连接定位于脑微血管相邻内皮细胞间，是维持体内BTB完整性重要的结构和功能基础，TJ开放BTB的通透性增加。Claudin-5和occludin是目前研究TJ的标志蛋白，两者结构和表达水平的变化在TJ功能的调节中起重要作用。而通过跨细胞途径增加BTB通透性主要是通过增加吞饮小泡(caveolae)的数量完成的，caveolin-1和caveolin-2是caveolae的基本成分，在保持caveolae形状、结构和功能的过程中发挥了关键作用，是影响BTB通透性的重要靶点
　　血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）是一种具有高度生物活性的功能性糖蛋白，在已知的微血管通透性诱导物中作用最强，其效应比组胺强50000倍。罂粟碱(papaverine，PA)是一种阿片类生物碱，作为一种强效扩血管药物已在临床应用多年。颈内动脉注射罂粟碱可以导致BTB通透性的增加，脑胶质瘤局部含药量增高。两药开放BTB的机制还不是很清楚，研究发现VEGF能促进NO释放，激活鸟苷酰环化酶，产生高浓度cGMP，而罂粟碱也能抑制磷酸二酯酶活性，增加细胞内cAMP和cGMP水平，据此我们推测，联合应用VEGF与PA可能最终通过某些相同的途径，以协同作用的方式增加BTB的通透性。
　　本研究是为了明确单独应用外源性VEGF能否通过调节紧密连接相关蛋白claudin-5和occludin的表达水平，开放紧密连接，通过细胞旁途径增加BTB的通透性，联合应用VEGF和PA在开放紧密连接方面是否具有协同作用;以及VEGF和PA能否通过caveolae介导的跨细胞途径，增加内皮细胞的吞饮小泡的数量，增加BTB的通透性，联合应用VEGF和PA在此方面是否具有协同作用。
　　方法
　　1、大鼠C6脑胶质瘤模型的制备。
　　2、应用伊文氏兰(evansblue，EB)渗透法评估VEGF、联合应用VEGF与PA前后脑胶质瘤大鼠BTB通透性变化。
　　3、应用透射电镜技术观察VEGF、联合应用VEGF与PA前后血管内皮细胞间紧密连接的状态和内皮细胞中吞饮小泡数量的改变。
　　4、应用免疫组织化学法检测VEGF、联合应用VEGF与PA前后脑胶质瘤大鼠肿瘤组织微血管中紧密连接相关蛋白claudin-5和occludin的分布和表达水平的变化;检测联合应用VEGF与PA前后脑胶质瘤大鼠肿瘤组织微血管中caveolin-1和caveolin-2的分布和表达水平变化。
　　5、应用Westernblot法检测VEGF、联合应用VEGF与PA前后脑胶质瘤大鼠肿瘤组织微血管中紧密连接相关蛋白claudin-5和occludin的蛋白质表达水平的变化;检测联合应用VEGF与PA前后脑胶质瘤大鼠肿瘤组织微血管中caveolin-1和caveolin-2的蛋白表达水平的变化。
　　结果
　　1、成功建立了大鼠C6脑胶质瘤模型。
　　2、VEGF作用后，C6脑胶质瘤大鼠肿瘤组织血管内皮细胞间紧密连接逐渐开放，BTB通透性逐渐增加，上述各指标在0.05ng/gVEGF作用45min时变化最明显，以后逐渐恢复，联合应用VEGF与PA后BTB通透性变化更明显。
　　3、VEGF作用后，C6脑胶质瘤大鼠肿瘤组织微血管中内皮细胞的紧密连接相关蛋白claudin-5和occludin在表达逐渐减少，在45min时达最低值，以后逐渐恢复，联合应用VEGF与PA能够以协同作用的方式下调claudin-5和occludin的表达水平。
　　4、单独应用VEGF或PA后，C6脑胶质瘤大鼠肿瘤组织微血管中吞饮小泡数目增加，同时上调质膜微囊结构蛋白caveolin-1和caveolin-2的蛋白表达水平。联合应用VEGF与PA能够以协同作用的方式增加吞饮小泡数目，上调caveolin-1和caveolin-2的蛋白表达水平。
　　讨论
　　我们的研究证明，VEGF作用后，紧密连接开放，BTB的通透性显著增加。紧密连接相关蛋白claudin-5和occludin的表达水平都显著低于对照组，在VEGF作用45min达最低值;联合应用VEGF与PA能够以协同作用的方式增加BTB的通透性，同时点紧密连接处于开放状态，并下调紧密连接相关蛋白claudin-5和occludin的表达水平。单独应用VEGF或罂粟碱能够增加吞饮小泡的数量，同时上调质膜微囊结构蛋白caveolin-1，caveolin-2的表达水平;联合应用VEGF与PA能够明显增加吞饮小泡的数量，并以协同作用的方式上调质膜微囊结构蛋白caveolin-1，caveolin-2的表达水平。
　　VEGF的两个主要生物学特征就是增加血管通透性并促进血管生成。以前研究发现单次注射1μg的VEGF可以显著破坏血脑屏障，使通透性增加，这可能与脑肿瘤组织中VEGF受体mRNA的表达明显增加有关。我们通过伊文氏兰渗透法证明了VEGF能有效增加BTB的通透性，并且肿瘤组织中伊文氏兰的含量在VEGF作用45min时达到最大值。我们应用透射电镜观察VEGF对脑胶质瘤大鼠肿瘤组织微血管TJ的影响时发现，VEGF作用后TJ逐渐开放，在VEGF作用45min时开放最明显，而后逐渐恢复。综上所述，我们认为，VEGF能够选择性开放血肿瘤屏障的紧密连接。Claudin-5和occludin是目前公认的紧密连接相关蛋白，它们的分布和表达水平变化直接影响紧密连接的结构和功能。我们的结果显示，VEGF能够减少紧密连接相关蛋白的表达水平，其变化趋势与伊文氏兰渗透评估实验相一致，说明VEGF可通过下调紧密连接相关蛋白claudin-5和occludin的表达，开放紧密连接，经细胞旁途径增加BTB的通透性。罂粟碱是临床上常用的血管扩张剂，利用其强大的扩血管作用，可使BTB开放。我们的研究证明联合应用VEGF与罂粟碱能够以协同作用的方式增加BTB的通透性，同时点紧密连接处于开放状态，并下调紧密连接相关蛋白claudin-5和occludin的表达水平，提示claudin-5和occludin是两药共同的作用靶点之一。
　　跨细胞途径是主要通过细胞表面的caveolae介导的囊泡载体的内吞过程实现的。有研究证明VEGF可以促进ATP敏感性钾通道(KATP通道)和钙离子激活性钾通道(KCa通道)在血管内皮细胞中的表达，而肿瘤血管内皮细胞上KCa和KATP通道是血肿瘤屏障上跨细胞途径的重要靶点，它们的激活能有效地诱导脑肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞上转运囊泡的加速形成。以前的研究发现，罂粟碱是通过抑制磷酸二酯酶活性，增加细胞内cGMP水平而发挥作用，而cGMP类似物，dbcGMP通过调节Ca2+依赖性钾通道，可增加吞饮小泡的数量，并且脑微血管内皮细胞小囊泡的密度也有增加。我们的研究结果与上述研究相一致，单独应用VEGF或罂粟碱能够增加吞饮小泡的数量，联合应用VEGF与罂粟碱能够更明显增加吞饮小泡的数量，同时以协同作用的方式上调质膜微囊结构蛋白caveolin-1，caveolin-2的表达水平。
　　上述结果证明，联合应用VEGF与罂粟碱能够以协同作用的方式，通过下调紧密连接相关蛋白claudin-5和occludin的表达水平，开放紧密连接;通过上调质膜微囊结构蛋白caveolin-1和caveolin-2的表达水平，增加吞饮小泡的数量，从而增加BTB的通透性。我们首次在分子水平上证明，联合应用VEGF与罂粟碱能够通过开放紧密连接的细胞旁途径和增加吞饮小泡的跨细胞途径增加BTB的通透性。
　　结论
　　1、0.05ng/g的VEGF调节BTB的通透性的效果优于其他剂量组，VEGF作用后，BTB的通透性逐渐增加，45min时效果最明显，同时点紧密连接处于开放状态，而后BTB的通透性逐渐下降，120min时基本恢复正常，紧密连接处于关闭状态。
　　2、VEGF增加BTB的通透性，同时下调紧密连接相关蛋白claudin-5和occludin的表达水平，45min达到最低值，120min时基本恢复正常。
　　3、联合应用VEGF与罂粟碱能够以协同作用的方式增加BTB的通透性，同时点紧密连接处于开放状态。
　　4、联合应用VEGF与罂粟碱能够以协同作用的方式下调紧密连接相关蛋白claudin-5和occludin的表达水平。
　　5、单独应用VEGF或罂粟碱能够增加吞饮小泡的数量，同时上调质膜微囊结构蛋白caveolin-1，caveolin-2的表达水平;联合应用VEGF与罂粟碱明显增加吞饮小泡的数量，并以协同作用的方式上调质膜微囊结构蛋白caveolin-1，caveolin-2的表达水平。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 血管内皮生长因子对血肿瘤屏障紧密连接的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 紧密连接相关蛋白claudin-5和occludin在联合应用VEGF与罂粟碱开放血肿瘤屏障中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 联合应用VEGF与罂粟碱对血肿瘤屏障质膜微囊结构蛋白的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 VEGF家族及其受体的研究与应用进展

在学期间科研成绩

致谢

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