组织工程方法修复大鼠棘上、棘间韧带的实验研究

摘要

目的：脊柱骨折的患者常并发棘上韧带、棘间韧带损伤。但是韧带损伤后不愈合或瘢痕愈合，常导致明显的关节功能丧失和疼痛。而且尽管韧带损伤后可以自愈，但愈合后韧带的超微结构及生化构成发生了很大改变，即使在韧带愈合后若干年内，其生物力学特性仍较正常韧带差。近年来国内外的学者尝试采用生物学的方法来促进韧带的愈合。其主要方法有细胞因子治疗、基因治疗和组织工程方法等。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)．作为干细胞的一种，具有多方向分化的潜能。本实验以MSCs为种子细胞，用组织工程的方法来促进韧带的愈合。观察该方法促进大鼠棘上、棘间韧带损伤愈合的效果。 方法：1.MSCs的体外培养。利用密度梯度离心法分离获取大鼠股骨MSCs。以2.0×105/mL的密度接种于DMEM培养液中。原代细胞增殖达到铺满瓶底约80％时，按1：3比例进行传代。2.细胞—胶原海绵复合体的制备。在第三代细胞的培养液中加入3mg/L BrdU培养24小时予以标记。然后用胰蛋白酶消化，并制成细胞悬液，用DMEM培养液稀释成10×106/mL的浓度，将其滴到已用紫外线消毒的胶原海绵上，5％ CO2孵育箱中37℃恒温培养24小时，使细胞吸附于胶原海绵上制成细胞——胶原海绵复合体。3.动物模型的建立。切断大鼠LA—L5间的棘上、棘间韧带。实验组将细胞—胶原海绵复合体移植于损伤处，对照组仅移植以胶原海绵。4.HE染色。于移植后第4周处死动物，切取标本，作组织学检查。每个标本选取一张切片进行HE染色。5.免疫组化染色。再次选取每个标本的切片，做免疫组化染色。胞核棕黄色者为阳性染色细胞。 结果：1.MSCs的体外培养。倒置显微镜下观察可见，MSCs接种3天后即有部分细胞贴壁。培养12—14天细胞生长成单层。传代后，MSCs增殖明显加快9—10天既可融合成单层。2.动物模型结果：20只动物均存活良好。3.组织学观察结果：实验组术后4周可见6例移植处形成韧带样组织，可见形态一致、排列方向与正常组织接近的成纤维细胞，类似正常韧带组织。对照组所形成的新生组织含较多脂肪组织且细胞排列紊乱，胶原纤维呈松散网丝状。两组间愈合较优者所占比率的差异具有显著性(P<0.05)。4.免疫组化结果：于实验组切片可见胞核为棕褐色的阳性细胞。对照组未见阳性染色细胞。 讨论：MSCs为较为理想的种子细胞。使用Ⅰ型胶原作为载体也较为合理。修复损伤韧带的部分组织来源于移植的MSCs。MSCs在不添加外源性生长因子的情况下，可在体内对韧带缺损进行有效修复。实验组韧带恢复较好，对照组恢复的相对较差。 结论：应用组织工程技术以MSCs修复棘上、棘间韧带损伤具有可行性。该方法可以促进韧带的愈合，其愈合效果好于韧带自然愈合的效果。

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前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 韧带愈合的研究进展

致谢

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