多巴酚丁胺增加内毒素致肺损伤大鼠的肺泡液体清除率及AQP5和cAMP的表达

摘要

目的：
　　 急性呼吸窘迫综合症(ARDS)，是严重的急性肺损伤(ALI)，以微血管的通透性增加，严重的低氧血症，弥漫性的肺侵润为特点，其临床病死率可以达到40-50％。本研究探讨了多巴酚丁胺对急性肺损伤大鼠的肺泡液体清除率(AFC)以及水通道蛋白5(AQP5)及环磷酸腺苷(cAMP)表达的影响。
　　 实验材料：
　　 1、实验动物
　　 健康Wistar大鼠64只，雄性，体重(3—4月龄，300-350g)，中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。
　　 2、实验试剂
　　 戊巴比妥钠(上海化学试剂采购供应站)；多巴酚丁胺(上海第一生化制药)；大肠杆菌内毒素LPS(Escherichia coli)(Sigma，USA)；EVANS蓝(Sigma，USA)；水通道蛋白5抗体(Anti-aquaporin5)andβ肌动蛋白抗体(anti-β-actin)(AlphaDiagnostic International，USA)；Trizol(Invitrogen，USA)；AQP5 andβ-Actin cDNAPrimers(Shanghai Genebase Gen-Tcch Ltd，China)；RT-PCR试剂盒(Promega，美国)；聚偏二氟乙烯(PVDF)蛋白印迹膜(Bio-Rad，美国)；逆转录酶、PCR所需酶和其他试剂(Takara公司，日本)；PBS等其他试剂为国产
　　 3、主要实验仪器
　　 (1)小型动物呼吸机(Harvard638型，美国)
　　 (2)超低温冰箱(SANYO MDF-U，日本)
　　 (3)烘箱(上海跃进)
　　 (4)水浴箱(上海跃进医疗器械厂)
　　 (5)分光光度仪(岛津公司，日本)
　　 (6)微量输液泵(JMS，美国)
　　 (7)水平板电泳系统(BIO—RAD sub-cell GT，美国)
　　 (8)通用电泳仪(BIO-RAD PowerPac200，美国)
　　 (9)台式低温高速冷冻离心机(Sigma3K30，美国)
　　 (10)压力换能器(Edwards LifeSciences，美国)
　　 (11)自动电泳凝胶成像分析仪(Alphainnotech Chemilmager，美国)
　　 (12)小型垂直电泳仪(Bio—Rad Mini-Protein III，美国)
　　 (13)半干转印仪(Bio-Rad Seimidry transfer system，美国)
　　 (14)自动封膜仪(江苏仪器设备公司，中国)
　　 (15)HEIDOLPH DIAX900型匀浆机(德国)
　　 (16)PTC-100型PCR扩增仪(美国)
　　 (17)GLS-700D型数码凝胶扫描分析系统(上海，中国)
　　 (18)A-200Ds电子天平(美国)
　　 (19)超纯水转装置(MILLIPORE MILLI-Q，美国)
　　 (20)实验室制冰机(ZIGERA2BE-70-35，德国)
　　 (21)恒温震荡培养箱(GFL，德国)
　　 (22)小型台式离心机(SIGMA1-13，美国)
　　 (23)PH计(WTW InoLab，德国)
　　 (24)电动高压消毒锅(HIRAYAMA HVE-50，美国)
　　 (25)倒置相差显微镜(OLYMPUS，日本)
　　 (26)JUNG-CM1800型切片机(上海)
　　 (27)VITRO1250血液生化自动分析仪(美国)
　　 (28)惠普监测仪(美国)
　　 实验方法：
　　 本研究通过静脉注射内毒素制作ALI的模型，通过持续静脉泵入多巴酚丁胺作为干预措施，机械通气120分钟后，通过分光光度仪，在波长620nm处测定Evans蓝标记的白蛋白浓度来测定不同组大鼠的肺泡液体清除率(AFC)；应用Western-blot，测定大鼠肺组织水通道蛋白5(AQP5)的表达；应用RT-PCR的方法测定大鼠肺组织AQPSmRNA的含量；通过放射免疫的方法测定肺组织中环磷酸腺苷(cAMP)的含量；比较各组数据之间的差异性。
　　 动物模型制备：大鼠称重，腹腔注射戊巴比妥钠50mg/kg麻醉，仰卧位固定。气管切开置入气管插管，接动物呼吸机。容量控制通气，潮气量10ml/kg，呼气末正压3cmH2O(1cmH2O=0.098kPa)，呼吸频率35～50次/min，吸入氧浓度(FiO2)100％。调节呼吸频率，保持动脉血二氧化碳分压35～50 mmHg(1mmHg=0.133kPa)。维持动脉收缩压90～130mmHg，心率260～300次/min。分离股动、静脉，分别置入血管导管。静脉注射内毒素10 mg/kg，复制急性肺损伤模型。
　　 分组情况：按随机数字法将动物分为4组，正常对照组(实验开始时静脉注射等量生理盐水，Saline组)、多巴酚丁胺对照组(实验开始时静脉持续注射多巴酚丁胺10μg/kg/min，Saline+Dobu组)，前两组为非ALI组；急性肺损伤组(实验开始时静脉注射内毒素10mg/kg，LPS组)、多巴酚丁胺治疗组(实验开始时静脉注射内毒素10mg/kg后，静脉持续注射多巴酚丁胺10μg/kg/min，LPS+Dobu组)，为ALI组。循环稳定20～30 min后，开始实验(0 h)。
　　 实验结束(120分钟)，用腹主动脉放血法处死大鼠，取材。
　　 结果：
　　 1、多巴酚丁胺对肺损伤大鼠的肺泡液体清除率(AFC)的影响。
　　 在LPS组，肺泡液体清除率(AFC)是15.8±2.61％，而LPS+Dobu组的肺泡液体清除率(AFC)是25.2±3.5％。与LPS组相比，持续静脉内注射多巴酚丁胺能够显著的提高肺泡液体清除率(AFC)70％(Fig1 A)，P<0.01，在非ALI的Saline组和Saline+Dobu组，多巴酚丁胺对肺泡液体清除率(AFC)的影响并无差异(Fig1B)。
　　 2、多巴酚丁胺对AQP5 mRNA和蛋白表达的影响
　　 RT-PCR显示，在LPS组AQP5 mRNA水平与β-Actin比值为0.03±0.0022，而LPS+Dobu组是0.41±0.01，LPS+Dobu组的AQP5 mRNA的表达水平是对照组的13倍，P<0.01(Fig2A，通过Western-blot也证实，在LPS+Dobu组AQP5的蛋白表达显著升高(Fig2C)；而在非ALI的Saline组和Saline+Dobu组相比较，无论在基因水平还是在蛋白表达水平均无差异(Fig2B，2C)，Western-blot定量分析也证实了上述结果(Fig2D)。
　　 3、多巴酚丁胺对肺损伤大鼠肺组织的cAMP的表达。
　　 cAMP含量在LPS组大鼠肺组织的表达是22.3±7.6pmol/mg，而LPS+Dobu组是237.9±32.1pmol/mg。多巴酚丁胺显著增加肺损伤大鼠的肺的cAMP的表达，LPS+Dobu组是LPS组的7倍，P<0.01(Fig3A)。而在非ALI组多巴酚丁胺亦增加肺的cAMP的表达，但是Saline+Dobu组是Saline组的2倍，P<0.01，(Fig3B)。
　　 讨论：
　　 大多数的ALI和ARDS的病人的肺泡液体清除功能受到损害，而良好的肺泡液体的清除往往提示着良好的预后。众所周知，β肾上腺素能激动剂能够刺激肺泡上皮细胞钠的转运和水的清除。作为一种临床广泛应用的β肾上腺素能激动剂，多巴酚丁胺能够增加机械通气大鼠的肺泡液体的清除，我们的研究首次提示，在内毒素所致的肺损伤大鼠的模型中，多巴酚丁胺可能通过调节AQP5表达和cAMP含量来增加肺泡液体清除率。
　　 我们认为，在LPS+Dobu组肺损伤大鼠，AQP5蛋白表达的上调与多巴酚丁胺的处理有关。我们知道，AQP5对气道粘膜下腺体的分泌有重要的影响，然而，虽然AQP5对氯和钠的转运最初在囊性纤维化的研究中发现，但其分子层面的机制并不清楚。
　　 cAMP调节水通道蛋白的最明确的例子是肾脏细胞的水通道蛋白2(AQP2)，而在水通道家族，AQP5的遗传学特征与AQP2是最接近的。也有报道，cAMP调节肺泡上皮细胞AQP5的分布和浓度，而cAMP的水平受到β肾上腺素能激动剂的调节。短期(数分钟)暴露与cAMP，会产生AQP5的内在关闭和细胞膜上丰度的下降，而长时间的暴露于cAMP则增加AQP5的分布与丰度。上述反应均可被蛋白激酶A的抑制剂所阻断。在我们的研究中，我们观察到持续多巴酚丁胺处理2小时后cAMP的水平升高，显示多巴酚丁胺诱导了在体的cAMP的表达，这种多巴酚丁胺对cAMP-AQP5的调节作用，对于临床ALI的治疗可能具有重要的作用。
　　 我们的研究显示，在内毒素所致的肺损伤大鼠的模型中，持续静脉注射多巴酚丁胺能够增加AFC，增加AQP5和cAMP的表达，提示多巴酚丁胺对肺水清除(AFC)的影响可能通过cAMP和AQP5来完成，对上述机制的进一步的研究，可能为ALI的进一步的靶向治疗提供帮助。
　　 结论：
　　 在内毒素所致的急性肺损伤大鼠的模型中，持续静脉注射多巴酚丁胺能够增加肺泡液体的清除率(AFC)，减少肺水含量；同时也增加AQP5和cAMP的表达，提示多巴酚丁胺对肺水清除(AFC)的影响可能通过AQP5和cAMP来完成。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语

声明

前言

论文一 多巴酚丁胺对内毒素致肺损伤大鼠的肺泡液体清除率(AFC)的影响

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

论文二 多巴酚丁胺对内毒素致肺损伤大鼠肺的水通道蛋白5(AQP5)及AQP5mRNA表达的影响

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

论文三 多巴酚丁胺对内毒素致肺损伤大鼠肺的环磷酸腺苷(cAMP)表达的影响

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述：β肾上腺能激动剂与急性肺损伤的肺水清除、水通道蛋白

在学期间科研成绩

致谢

个人简历