放线菌素D诱导V79细胞旁观者效应及其机制和旁观者因子筛选的实验研究

摘要

前言：旁观者效应的发现由来已久，但研究几乎都集中在α粒子、中子、γ射线、X射线等高能量的电离辐射所诱导的旁观者效应(bystander effect，BE)上，对于非电离辐射的其他理化因素所诱导的BE报道较少。2002年，Xiao等首次报道UVA可诱发旁观者效应；而且UVA照射后，濒死细胞的无细胞培养液(conditionmedium，CM)也能诱导旁观者效应。该结果提示除电离辐射外，非电离辐射等其他理化因素也有引起BE的能力。由于BE是原有损害效应的延续与放大，其毒理学意义受到人们的广泛关注。
　　 而化学因素引起靶细胞的DNA损伤诱导旁观者效应的相关研究很少。直到近几年才有三篇关于烷化剂的研究，发现化学物质也可能诱导旁观者效应。但其他化学毒物(遗传物质损伤剂等)是否能引起旁观者效应及其特征尤其是发生机制的研究几乎还是一片空白。旁观者效应的发生机制尚不十分清楚，经由不同途径死亡的靶细胞所产生和释放的旁观者因子的性质更没有确定。
　　 本课题主要就化学物角度，首次采用经典的致凋亡物质放线菌素D(Actino-mycin，ActD)来制作靶细胞DNA损伤凋亡模型，来研究旁观者效应情况及其发生机制，并对旁观者因子进行筛选。
　　 1、用不同剂量ActD处理V79细胞不同时间，观察各指标变化，确定最适的条件来建立靶细胞凋亡模型，为后续研究靶细胞在凋亡过程中能否产生和释放引起旁观者效应的因子以及效应因子的性质提供实验基础资料。
　　 2、利用ActD所致V79细胞凋亡模型，取不同时段靶细胞去细胞培养液CM，培养旁观者细胞，以存活率、死亡方式、染色体畸变、超微结构改变为检测终点，确定凋亡进程中CM是否能够诱导旁观者效应及效应最强时段，为阐明DNA损伤类型(凋亡)与旁观者效应之间的关系提供重要线索，为筛选旁观者因子打下基础。
　　 3、采用CM培养旁观者细胞，观察不同时段CM对DNA损伤反应和凋亡关键基因p53，Bax，Bcl-2的表达水平。同时检测ROS水平、细胞周期及线粒体膜电位(△Ψm)变化，推测线粒体通路在导致旁观者细胞凋亡中的作用及其他可能通路的情况。为研究化学因素诱导旁观者细胞凋亡机制提供实验依据与资料。
　　 4、将旁观者效应最强的4h时段CM与对照组CM进行2D电泳，应用MALDI-TOF MS进行一级和二级质谱分析，以筛选和鉴定可能存在的旁观者因子。为确证旁观者效应发生的确切机制提供重要资料和线索。
　　 方法：
　　 1、ActD所致V79靶细胞凋亡模型的建立
　　 (1)细胞及培养中国仓鼠成纤维细胞V79-C3细胞株(购自北京中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)。细胞株于含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中，37℃，5%CO2培养箱内培养，隔天传代。
　　 (2)细胞长至对数生长期，加入不同剂量ActD(0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0mg/L)处理细胞(0.5，1，2，4h)。用PBS洗3次，加正常培养液培养24h：
　　 MTT法酶标仪上测细胞存活率；
　　 Annexin V-FITC/PI双染，流式细胞仪检测细胞凋亡/坏死率；
　　 相差显微镜观察细胞形态学；
　　 染色体畸变分析检测靶细胞染色体损伤；
　　 Hoechst33258染色；Annexin V-FITC/PI双染，荧光显微镜下观察凋亡情况；
　　 透射电子显微镜观察靶细胞超微结构的改变。
　　 2、ActD处理V79细胞后CM诱导旁观者效应的实验研究
　　 (1)不同时段去靶细胞培养液(CM)的获取以4mg/LActD处理1h作为计时的起点，分别在第4h、8h、12h和24h取细胞培养液0.22μm滤器过滤后加入到正常的V79-C3细胞(旁观者细胞)中，再培养24h后，进行旁观者效应的观察。
　　 (2)细胞在培养瓶中长到75%融合时分别加入不同时段(4h、8h、12h、24h)去细胞培养液培养24h，观察指标与靶细胞相似：
　　 相差显微镜观察细胞形态学并拍照。
　　 MTT法测定细胞存活率。
　　 常规的染色体畸变分析方法制片，在普通光学显微镜下观察染色体损伤。
　　 AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
　　 透射电镜下观察细胞超微结构的改变。
　　 3、ActD所致V79细胞旁观者效应机制的研究
　　 (1)RT-PCR方法检测p53、Bcl-2、Bax mRNA水平将对数期生长的正常细胞加入不同时段(4h、8h、12h、24h)CM培养24h，加入设计的各引物，RT-PCR方法检测p53、Bcl-2、Bax mRNA水平。
　　 (2)蛋白测定将处理后的细胞爬片丙酮固定，参照SABC试剂盒免疫组织化学染色法检测旁观者细胞p53蛋白表达；对数期生长的正常细胞加入不同时段(4h、8h、12h、24h)CM培养24h，Western blotting法检测细胞Bcl-2、Bax蛋白质表达水平。
　　 (3)细胞周期测定方法对数期生长的正常细胞加入不同时段(4h、8h、12h、24h)CM培养24h，PI染色，流式细胞仪检测。计算G0/G1期，S期和G2/M期细胞数。
　　 (4)流式细胞仪测定旁观者细胞ROS和线粒体膜电位(△Ψm)对数期生长的正常细胞加入不同时段(4h、8h、12h、24h)CM培养24h，2’，7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)荧光染色检测ROS活力；Rh123(Rhodamine123)荧光染色检测线粒体膜电位(△Ψm)。
　　 (5)细胞色素C含量测定采用改良的张均田法测定。细胞处理结束后，分别收集线粒体和胞质。取待测样品，加少许连二亚硫酸钠，520nm比色。
　　 4、旁观者因子的筛选
　　 (1)样品的制备样品超滤浓缩，沉淀室温干燥，加入裂解液，Bradford法测蛋白浓度，-80℃保存。
　　 (2)2D电泳、染色、差异蛋白点比对第一向等电点聚焦，第二向SDS-PAGE电泳，硝酸银染色。凝胶用图像扫描仪扫描，选择正常对照组CM蛋白质的凝胶图像作为参考胶，旁观者效应最强时段组CM凝胶图像与之进行比对，比对分析采用ImageMaster2D Elite4.O1软件。
　　 (3)差异蛋白质的MALDI-TOF质谱分析将银染凝胶胶内原位酶解，MALDI-TOF-MS质谱仪进行一级二级质谱，肽质量指纹图谱分析，鉴定蛋白质。
　　 (4)肽质量指纹图谱的数据库查询将MALDI-TOF-MS肽质量指纹图谱分析得到的数据(肽片段质量)搜索数据库，从而鉴定蛋白。
　　 5、数据处理
　　 使用SPSS11.5软件对实验数据进行统计学处理。计量资料用单向方差分析(ANOVA)，LSD法进行两两比较；计数资料用X2检验分析。检验水准α=0.05。
　　 结果：
　　 1、MTT法检测ActD对靶细胞存活率的影响，细胞形态学的观察，流式细胞仪分析均发现4.0mg/L处理1h时细胞凋亡率最高坏死率较低达到建立V79细胞凋亡模型的目的。同时，用荧光染色和透射电镜观察也证实了在该条件下细胞的改变主要是凋亡。而且染色体畸变实验也表明ActD是一种DNA损伤剂，可以引起V79细胞的染色体畸变。
　　 2、观察不同时段CM所致旁观者效应。细胞形态、存活率及染色体分析显示4hCM诱导旁观者细胞损伤的作用最强。随后逐渐减轻，24h时段又趋严重。凋亡率与之一致且与靶细胞一样死亡方式主要是凋亡。电镜观察各CM组细胞凋亡现象明显，4hCM处理组最重。各指标24h时段反弹现象可能是由于旁观者因子累积效应。
　　 3、研究结果发现，CM组p53mRNA和蛋白质表达水平均比对照组升高，与旁观者细胞凋亡率的变化一致，提示ActD诱导的旁观者细胞凋亡可能是p53介导的。旁观者细胞出现了G1期阻滞，Bax mRNA及蛋白质表达增加，Bcl-2mRNA及蛋白质表达下降，线粒体膜电位(△Ψm)下降，CytC释放增加，均说明p53通过线粒体途径参与了旁观者细胞的凋亡。且CM处理组ROS水平增加，提示氧化损伤途径可能也参与了旁观者细胞的凋亡。故我们推测p53-Bcl-2、Bax-CytC-caspase3(即线粒体通路)途径在导致ActD的CM引起旁观者细胞凋亡中起重要的主导作用。
　　 4、用蛋白质组学技术筛选旁观者因子发现，实验组CM与对照组存在蛋白差异点，TPXⅡ明显降低。但尚需采用其它方法如检测其mRNA及蛋白水平对质谱结果进一步验证。
　　 结论：
　　 1、ActD可以引起V79细胞染色体的损伤，是一种V79细胞的化学诱变剂。其制作凋亡模型的最适剂量和时间为：4.0mg/L作用1h。
　　 2、凋亡过程中的去靶细胞培养液(CM)可以诱导旁观者效应。产生旁观者效应的最强时段为4h。旁观者细胞的死亡方式与靶细胞一样也以凋亡为主。24h时段反弹现象说明可能存在旁观者因子累积效应。
　　 3、p53可能通过线粒体途径介导了旁观者细胞的凋亡。CM处理组ROS水平增加，提示氧化损伤途径也可能参与了旁观者细胞的凋亡或者旁观者效应。
　　 4、质谱分析显示实验组CM与对照组CM存在蛋白差异点，TPxⅡ可能是其中之一。