UVC照射V79细胞诱导旁观者效应的实验研究

摘要

电离辐射是细胞遗传物质的强损伤剂。长期以来人们一直认为，辐射所致的生物学效应，如基因突变、染色体畸变、细胞死亡和致癌作用等是靶细胞DNA受到损伤后，自身无法修复或错配的结果，这些效应不会出现在未受照射的细胞中。辐射剂量与靶细胞效应之间具有剂量-效应关系，即辐射剂量越低，所致效应越弱。然而越来越多的研究发现，辐射所致的遗传学改变不仅出现在受照靶细胞的周围，而且可发生在位于靶细胞周围，或与靶细胞的培养液接触的未受照射的正常细胞(旁观者细胞，bystander cells)中，从而使效应明显增强。这种现象称为旁观者效应(bystander effect，BE)。由辐射引起损伤而产生旁观者效应的机制目前没有定论。其效应涉及到多种机制，不同于传统的辐射细胞效应。目前认为机制可能与受照细胞产生一些活性物质或信号分子有关。 除电离辐射外，紫外线照射的靶细胞也可诱导旁观者效应。本研究中，选择UVC处理V79细胞确定其引起DNA损伤的最适照射剂量，并收集该剂量下照射靶细胞不同时段的无细胞培养液；用此无细胞培养液培养正常细胞以观察细胞DNA损伤后诱发的旁观者效应，以及所诱发的旁观者效应的类型及强度，并通过分子生物学的技术手段初步探讨UVC诱导旁观者效应的可能机制。 材料和方法： 1、细胞培养： 中国仓鼠肺成纤维细胞V79-C3细胞株于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃，5％ CO2孵箱内培养。 2、靶细胞处理 细胞在75 ml细胞培养瓶中长到75％融合后，经胰蛋白酶消化，接种至6孔板，每孔1×106个细胞，继续培养12h。照射前去掉培养液，每孔用2mlPBS冲洗3次，去掉PBS。紫外线光源为黑光灯，发射波长为200-290nm之间，峰值为254nm，辐射强度为9mJ/cm2，将6孔板置于距光源正下方5cm处垂直照射，设定照射剂量分别为0mJ/cm2，90mJ/cm2，180mJ/cm2，270mJ/cm2，540mJ/cm2，810mJ/cm2，照射时间分别为0s，10s，20s，30s，60s，90s。 3、去细胞培养液的获取 使用最适照射剂量处理V79细胞后，分别于4h、8h、12h、24h吸取培养液经0.22μm微孔滤器过滤后低温保存、备用。 4、旁观者细胞 细胞在75 ml细胞培养瓶中长到75％融合后，经胰蛋白酶消化，接种至6孔板，继续培养12 h后去掉培养液，用不同时点的ICM(去细胞培养液)分别继续培养细胞24h。 5、检测方法 (1)细胞存活率：MTT法 (2)细胞形态学观察：照相显微镜观察 (3)细胞坏死/凋亡检测：流式细胞仪法 (4)染色体畸变：秋水仙素处理后Giema染色镜检 (5) ROS活力：流式细胞仪法 (6) P53 mRNA含量：TR-PCR (7) P53蛋白：免疫组化 (8)旁观因子的筛选：二维电泳和飞行质谱 结果： 1、在照射剂量为90、180、270、540、810mJ/cm2时，v79细胞的存活率分别为65.5±4.4％、50.4±3.5％、43.4±2.7％、38.8±2.9％和29.4±1.6％。 2、靶细胞的凋亡率分别为22.59±2.22％、48.89±3.67％、56.69±4.05％、64.57±4.66％和73.48±4.37％。 3、在180mJ/cm2UVC照射剂量下，取出不同时段去细胞培养液用来培养正常细胞，测得v79细胞的存活率分别为61.5±3.9％、78.8±3.3％、84.2±4.1和74.9±3.7％。 4、不同时段去细胞培养液作用v79细胞的凋亡率分别为20.78±2.38％、13.45±1.99％、10.51±1.53％和28.57±3.59％。 5、不同时段去细胞培养液作用v79细胞染色体畸变率分别为12.33％、8.67％、5.67％和15.00％。 6、不同时段去细胞培养液作用v79细胞ROS平均荧光强度分别为38.38±3.05、25.69±2.37、16.30±1.35和48.35±2.32。 7、不同时段去细胞培养液作用v79细胞P53蛋白含量灰度值分别为79.05±5.23、68.36±5.12、51.81±4.35和78.65±5.67。 结论： 1、本次研究中UVC引起旁观者效应的最适照射剂量为180mJ/cm2。 2、本次研究中UVC照射V79细胞引起的旁观者效应类型以凋亡为主。 3、本次研究中UVC照射V79细胞其去细胞培养液中存在的TNF-α转换酶可能是旁观因子之一。

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综述：电离辐射诱导的旁观者效应及其机制研究进展

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