CD36短发夹RNA干扰重组慢病毒抑制大鼠肺泡巨噬细胞L-TGF-β1活化及其阻抑矽肺纤维化的研究

摘要

在我国，尘肺是危害工人健康最严重的一类职业病，到2006年底我国累计已发生尘肺病616442例，占我国各类职业病的80％，并每年以8000-9000例的速度增长，其中矽肺患者占了尘肺病例的近80％。虽然我国在控制粉尘的产生和扩散、降低作业场所粉尘浓度、改善劳动环境方面做了大量工作，而且已取得了一定的成绩，但粉尘危害的形势依然严峻，尘肺病的预防和控制工作任重而道远。虽然尘肺病的肺组织已有的纤维化病变难以消除，但肺纤维化是一个慢性、进行性的病理反应过程，探索肺纤维化发病的分子机制以延缓或阻断纤维化发生发展进程的策略，仍具有重要的实际意义。 研究证明，转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)在肺纤维化的发生发展中起最关键的作用。肺损伤后肺巨噬细胞受到刺激而被激活，产生大量的TGF-β1；TGF-β1与肺成纤维细胞膜上TGF-β1的受体结合，激活细胞内TGF-β1的Smads家族蛋白信号传导途径；信号传入细胞核内，激活核内转录蛋白，启动胶原蛋白的mRNA转录，合成胶原蛋白，同时抑制胶原蛋白的降解；最终，引起肺纤维化。然而只有活化形式的TGF-β1才能与其受体结合发挥生物学作用。通常情况下，肺巨噬细胞被激活后，首先分泌大量潜在的非活化形式的TGF-β1(Latent-TGF-β1，L-TGF-β1)。这种L-TGF-β1不能与TGF-β1受体结合，因此无生物学活性。但被激活的肺巨噬细胞可合成血小板反应素—1(Thrombospondin—1，TSP—1)和纤溶酶，且分泌到细胞外的TSP—1能与L-TGF-β1特异结合，形成TSP—1/L-TGF-β1蛋白复合物，该蛋白复合物又通过TSP—1与肺巨噬细胞膜上TSP—1受体CD36特异结合而发生空间构象变化，此时邻近的纤溶酶才能作用于该蛋白复合物产生活化的TGF-β1。 RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)是一种可靠的能够阻止或抑制基因表达的方法，它主要通过与目的基因mRNA相同序列的21—23nt双链小分子干扰RNA(small interference RNA，siRNA)或发夹状RNA(short hairpin RNA，shRNA)来特异性高效率的抑制目的基因的表达。慢病毒载体作为一种基因转移载体目前被广泛应用，它可感染非分裂细胞，并可将目的基因整合至靶细胞基因组而长期表达。通过慢病毒载体介导的RNAi，使长效抑制目的基因表达成为可能。 据此，我们选择在L-TGF-β1活化过程中发挥了重要作用的膜蛋白受体CD36为靶基因，利用RNAi技术构建大鼠CD36 shRNA慢病毒载体，并在体外、体内进一步观察其阻断L-TGF-β1活化及其阻抑实验性矽肺纤维化发生发展的效果，为研究探讨矽肺纤维化发生发展的分子机制奠定实验基础。 实验方法： 一、CD36基因shRNA重组质粒的构建与鉴定 根据大鼠CD36基因的编码序列，设计4条干扰靶序列和1条对照序列，并在两端加入酶切位点。将合成的正反向寡核苷酸链退火形成双链DNA，并连接到酶切后的pGCL—GFP载体上，然后转化至大肠杆菌DH5α感受态菌，经氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，采用PCR和DNA序列分析进行鉴定。构建的质粒分别命名为pGCL—GFP—CD36—1、pGCL—GFP—CD36—2、pGCL—GFP—CD36—3、pGCL—GFP—CD36—4、pGCL—GFP—CD36—NC。 二、CD36基因真核表达载体的构建与鉴定 利用RT-PCR技术从大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞中获得CD36的cDNA，将其克隆至真核表达载体pEGFP—N1中，然后转化至大肠杆菌DH5α感受态菌，经卡那霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，采用PCR、酶切和DNA序列分析进行鉴定。构建的质粒命名为pEGFP—N1—CD36。 三、western blot检测重组质粒pGCL—GFP—CD36在人胚肾细胞株293T细胞中干扰CD36表达的作用 脂质体介导法将pGCL—GFP—CD36—(1、2、3、4、NC)与pEGFP—N1—CD36按比例分别转染293T细胞中，转染48小时后收集各组细胞。提取总蛋白，进行western blot检测，筛选重组质粒pGCL—GFP—CD36—(1、2、3、4)中有效干扰CD36表达的靶序列。 四、重组慢病毒Lv—shCD36的包装以及滴度测定 将pGCL—GFP—CD36—(1、2、3、4、NC)重组质粒与pCMV—dR8.74包装质粒、pMD2G包膜蛋白质粒共转染293T细胞，转染后8小时更换新鲜培养基。继续培养40小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液。采用超速离心法浓缩获得高滴度的病毒。构建的重组慢病毒分别命名为Lv—shCD36—1、Lv—shCD36—2、Lv—shCD36—3、Lv—shCD36—4、Lv—shCD36—NC。分别将病毒感染293T细胞，将病毒培养液稀释8个梯度，然后荧光镜检GFP蛋白的表达水平来测定病毒滴度。 五、real time-PCR和western blot检测重组慢病毒Lv—shCD36在大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞中干扰CD36表达的作用 将重组慢病毒Lv—shCD36—(1、2、3、4、NC)分别感染NR8383细胞，8小时更换新鲜培养基，40小时后荧光镜检感染情况，继续培养48小时后收集细胞。分别提取细胞中的总RNA和总蛋白，用于real time-PCR和western blot检测，筛选重组慢病毒Lv—shCD36—(1、2、3、4)中有效干扰CD36表达的靶序列。 六、重组慢病毒Lv—shCD36在激活的NR8383细胞对L-TGF-β1活化的阻抑作用 实验分为博莱霉素(Bleomycin，BLM)组、BLM+Lv—shCD36组、BLM+Lv—shCD36—NC组。各组细胞均用浓度为0.1μg/ml的BLM刺激，18小时后，更换新鲜培养基。继续培养24小时，分别收集培养上清和细胞。采用real time-PCR和western blot方法检测激活的NR8383细胞中CD36的干扰效率。采用貂肺上皮细胞(CCL—64)增殖抑制实验检测培养上清中TGF-β1的活性。 七、大鼠矽肺模型中观察重组慢病毒Lv—shCD36对L-TGF-β1活化及矽肺纤维化的阻抑作用 取96只Wistar大鼠，雌雄各半，随机分为4组，每组24只。生理盐水组，气管内注入0.5mL生理盐水；SiO2模型组，气管内注入0.5mL含10mg SiO2的粉尘悬液；SiO2+Lv—shCD36组，气管内注入0.5mL含10mg SiO2和5×108TU重组慢病毒Lv—shCD36的粉尘悬液；SiO2+Lv—shCD36—NC组，气管内注入0.5mL含10mgSiO2和5×108TU重组慢病毒Lv—shCD36—NC的粉尘悬液。分别于7、21、28天分批处死动物。测定称重、肺湿重(含主支气管)。肺泡灌洗后，离心并收集上清，分离培养肺泡巨噬细胞2小时，荧光显微镜检测GFP荧光蛋白表达，并采用Realtime-PCR法检测CD36的干扰效率。采用CCL—64细胞增殖抑制实验测定各组肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中TGF-β1的活性。然后剪去主支气管称重，计算肺脏器系数。取右肺进行肺组织羟脯氨酸含量测定，左肺固定，常规石蜡切片，HE和vG染色，显微镜观察肺组织病理学改变。免疫组织化学技术检测肺组织中胶原Ⅰ和胶原Ⅲ型蛋白的表达。 八、统计分析 全部数据采用SPSS13.0统计学软件进行分析，统计结果表示为mean±S．E.M．，采用单因素方差分析比较各组间的统计学差异；当差异有统计学意义时，用SNK法进行组间比较，P<0.05具有统计学意义。 结论： 1、成功构建大鼠CD36 shRNA表达的重组慢病毒Lv—shCD36，并在大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞中证明其具有干扰CD36表达的作用。 2、重组慢病毒Lv—shCD36具有抑制激活的大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞分泌的L-TGF-β1活化作用。 3、重组慢病毒Lv—shCD36能够在大鼠矽肺模型中感染肺泡巨噬细胞，干扰其CD36的表达，并具有抑制肺泡灌洗液中L-TGF-β1活化和阻抑矽肺纤维化的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语

声明

论文一 大鼠CD36基因shRNA表达重组慢病毒载体的构建

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 重组慢病毒Lv-shCD36在大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞中抑制L-TGF-β1活化的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 重组慢病毒Lv-shCD36在大鼠矽肺模型中抑制L-TGF-β1活化和矽肺纤维化的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 CD36、TSP-1和纤溶酶与L-TGF-β1的活化

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