内毒素致肾集合管上皮细胞损伤与水通道蛋白2表达变化的实验研究

摘要

目的：
　　 内毒素血症是梗阻性黄疸时肾功能损害的重要的病理生理机制之一。之前本课题组通过研究大鼠梗阻性黄疸动物实验时发现,梗阻性黄疸时,肾集合管上皮细胞中AQP2的表达显著降低。本实验拟在大鼠内毒素血症模型及细胞水平上明确内毒素对大鼠肾集合管上皮细胞的作用,以及水通道蛋白2表达的变化。
　　 方法：
　　 选WISTAR大鼠用腹腔注射方法建立内毒素血症大鼠模型,根据LPS的作用时间处死取肾髓质,用免疫荧光及Western Blot方法检测AQP2表达。培养并传代大鼠肾髓质上皮细胞系mlMCD-3,选取处于指数生长期的细胞制作细胞爬片,免疫组化DAB染色法检测水通道蛋白2在大鼠肾髓质上皮细胞mIMCD-3的表达。分别用终浓度为0.1,0.5,1,5,10μg/L的内毒素与大鼠肾髓质上皮细胞mIMCD-3培养4h,8h,12h,24h后用CCK-8检测吸光度,计算细胞抑制率。选取作用明显的终浓度为10μg/L的内毒素分别作用于mlMCD-3及AQP2质粒转染后的mlMCD-3,在作用4h,8h,12h,24h后流式细胞仪检测凋亡。所有计数资料均用均数士标准差形式表示,运用统计软件SPSS13.0进行分析,P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 免疫组化和DAB染色可见,细胞胞浆中大量棕红色颗粒,呈片或呈堆积状排列,证明mIMCD-3表达AQP2。
　　 LPS抑制肾髓质上皮细胞mIMCD-3增殖。浓度低于5μg/L时,LPS的浓度变化对细胞增殖的抑制作用差别不大,增大浓度梯度时,LPS对细胞的抑制作用明显增强,具有浓度依赖性。浓度为0.1μg/L的LPS在对细胞作用的早期,对细胞不仅没有抑制,反而有增殖的作用。当作用时间增加到24小时时,相邻浓度组间的比较不具有统计学差异,各组间细胞的抑制率无差别。不同时间组分别行单因素方差比较,具有统计学差异(P＜0.05)。但0.1μg/L组4小时和8小时,0.5μg/L组4小时和8小时,8小时和12小时比较,1μg/L组4小时和8小时比较,不具有统计学差异(P＞0.05)。证明浓度低于1μg/L时,细胞的抑制率随时间变化不大。浓度大于等于5μg/L时,任意两两组间对比均具有统计学差异。LPS对mIMCD-3的抑制作用具有时间依赖性。
　　 LPS诱导肾髓质上皮细胞mIMCD-3凋亡。将终浓度为10μg/L的LPS溶液作用于肾髓质上皮细胞mlMCD-34h,8h,12h和24h后,经流式细胞仪检测,结果表明,LPS对mIMCD-3的抑制作用主要表现为细胞凋亡,随作用时间的延长,细胞凋亡率增加。
　　 对肾髓质上皮细胞mIMCD-3行组化染色可以看出,LPS作用于mIMCD-3后,AQP的表达下调,细胞中棕黄色颗粒变稀疏,且颜色变浅。浓度为10μg/L的LPS作用细胞4小时,8小时,12小时和24小时的平均光密度分析,作用时间4小时和对照组比较,不具有统计学差异,作用时间达到8小时后随作用时间延长AQP2表达逐渐下调。证明在短时间内,时间小于4小时,LPS对AQP2表达的变化没有影响,但随LPS作用时间的延长,AQP2的表达下降。
　　 结论：
　　 LPS可以造成肾髓质的损伤。LPS可以早期导致大鼠肾髓质AQP2表达下调,并且作用强度随时间延长而增加。LPS能够抑制mIMCD-3增殖,具有时间依赖性和剂量依赖性。LPS对细胞增殖的抑制作用主要表现为诱导细胞凋亡。随作用时间延长,细胞凋亡率增加。AQP2高表达的细胞在LPS作用后凋亡率较正常细胞降低,AQP2的高表达可以抑制mIMCD-3的凋亡。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语

论文一 LPS致大鼠肾髓质损伤与水通道蛋白2表达变化

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 内毒素对大鼠肾集合管上皮细胞的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 内毒素对高表达AQP2的大鼠肾集合管上皮细胞的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 内毒素血症肾功能损伤的治疗进展

致谢

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