Egr-1特异诱骗寡核苷酸调控原代培养的大鼠血管平滑肌细胞增殖及迁移的机制研究

摘要

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)过度增殖在动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等血管增殖性疾病的病理生理过程中起着重要作用,是引起血管内膜异常增生、血管重塑及血管再狭窄的主要细胞成分之一。从基因治疗角度调控’VSMC的增殖、迁移及凋亡是当前心血管疾病防治领域的研究热点之一。早期生长反应因子-1(early growth response factor-1,Egr-1)是一种锌指结构转录因子(transcription factor,TF),调控着多种与VSMC增殖相关基因的表达,诱导VSMC的分裂、增殖和内膜增生等。在外源性刺激时Egr-1表达增多,促进VSMC增殖,导致血管再狭窄等病理性血管修复反应,抑制其表达能够有效防止VSMC的异常增生,从而达到治疗疾病的目的。诱骗寡脱氧核苷酸(decoyoligodeoxynucleotides,decoy ODNs)技术是将与TF靶相结合位点(顺式作用元件)序列相同的人工合成双链寡核苷酸导入细胞内,竞争性诱骗TF与其结合,使TF所调控的能促进细胞增殖的下游基因表达受抑,从而在转录水平上达到抑制细胞增殖的目的。VSMC增殖、凋亡及迁移是动脉粥样硬化、再狭窄发生发展的关键因素,细胞周期又是调控VSMC多种病理过程的最终共同通路。因此,在本研究我们人工设计合成了针对Egr-1mRNA的decoy ODNs,转染原代培养的大鼠VSMC,观察转染ODNs后对Egr-1、细胞周期、增殖、凋亡、迁移及其相关基因表达变化的影响,进一步探讨Egr-1 decoy ODNs调控VSMC增殖、凋亡及迁移的作用机制和途径,为基因治疗血管增殖性疾病提供一个新的思路。
　　 实验方法
　　 1、Egr-1诱骗及诱骗对照寡脱氧核苷酸(decoy ODNs和decoyODNs SCR)的设计合成Egr-1的诱骗寡脱氧核苷酸(decoy ODNs)基因序列为:
　　 上游5’-TCG CCC TCG CCC CCG CTA AGGG-3’
　　 下游3’-AGC GGG GGC GGG GGC GAT TCCC-5’Egr-1的诱骗对照寡脱氧核苷酸(decoy ODNs SCR)基因序列为:同诱骗序列类似的错配双链寡脱氧核苷酸
　　 上游5’-AGC CGC ACC GGC CTG CCT CGTC-3’
　　 下游3’-TCG GCGTGG CCG GAC GGA GCAG-5’
　　 经聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化并冻干保存,在其3’和5’端进行硫代修饰,部分寡核苷酸的5’端用FITC标记,以便于在流式细胞仪(flow cytometry,FCM)和荧光显微镜下观察转染后基因的分布情况。寡核苷酸由大连宝生物试剂公司合成。
　　 2、原代大鼠VSMC培养及实验分组
　　 采用组织块贴壁法原代培养:体重100～120g Wistar大白鼠(中国医科大学实验动物中心提供),无菌条件下取出胸主动脉,中膜切块贴壁,滴加含20％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素pH7.4的Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM),置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养。0.25％胰酶消化传代,传代以后使用含10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素pH7.4的DMEM维持细胞生长。经形态学观察和采用α-平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)免疫细胞化学染色鉴定为VSMC。选取3～8代细胞进行实验。
　　 实验分组为:对照组、诱骗组、SCR组。实验时各组细胞均使用含10％FBS的不含抗生素DMEM培养液培养；诱骗组转染0.1μmol/L Egr-1 decoy ODNs；SCR组转染0.1μmol/L Egr-1 decoy ODNs SCR。
　　 3、寡脱氧核苷酸(ODNs)的细胞内转染
　　 VSMC使用含10％FBS不含抗生素的DMEM培养,生长至70％后更换无血清无抗生素DMEM培养30h,进行第一次基因转染,18h后更换含10％FBS无抗生素的DMEM进行二次转染。FuGENE6-ODNs转染复合物制备:在1.5ml无菌Eppendorf管中加入无血清无抗生素DMEM,再取适量的FuGENE6加入Eppcndorf管中混匀并孵育5rain,按FuGENE6与ODN 3:1(体积与质量之比)的比例分别加入Decoy ODNs、Decoy ODNs SCR并混匀,室温孵育15min。以0.1μmol/L终浓度将转染复合物逐滴加入相应分组细胞中,转染结果用荧光显微镜和FCM观察检测。
　　 4、电泳迁移率变动分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)
　　 收集各组培养细胞提取核蛋白。4μg核蛋白提取物与30pmol生物素标记的探针(大连宝生物公司合成,序列略)进行杂交(按Roche说明书操作),取杂交反应液10μl经6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(100V,40分钟)后转膜(Amersham公司),加入1:20稀释的发光液(宁波唯奥)暗室曝光显影。为证明ODNs与Egr-1结合的特异性,加入突变探针进行对照。
　　 5、实验检测方法
　　 噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2 yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]比色法和5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoyuridine,BrdU)掺入法测定ODN转染对VSMC增殖的影响；FCM分析ODNs转染对VSMC细胞周期分布的影响；用FCM、电镜和荧光显微镜检测ODNs转染对VSMC超微结构及凋亡的影响；用改良的Boyden小室法(Transwell)、划痕损伤法测定ODNs转染对VSMC迁移的影响；用RT-PCR检测Egr-1、PCNA、cyclin D1、CKD4、p53、p21、MMP-14、MMP-2、TIMP-2mRNA表达的变化,用Western blot检测细胞Egr-1、PCNA、cyclin D1、CKD4、p53、p21、MMP-14、MMP-2、TIMP-2蛋白表达水平。
　　 结论：
　　 1、Egr-1 Decoy ODNs可特异性地抑制Egr-1及其相关基因的表达,抑制10％FBS诱导的体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖,此作用与其抑制cyclinD1、CDK4、PCNA表达,阻止细胞周期由G0/G1期向S期转换,抑制S期细胞合成有关。
　　 2、Egr-1 Decoy ODNs可特异性地与Egr-1蛋白相结合,竞争性的占据了Egr-1与DNA的结合位点,抑制Egr-1自身转录表达,从而抑制MMP-14表达,减少MMP-2的激活,进而能够抑制VSMC迁移。
　　 3、Egr-1 Decoy ODNs、Egr-1 Decoy ODNs SCR对VSMC凋亡无影响。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略语

论文一、Egr-1特异诱骗寡核苷酸调控细胞周期抑制原代培养的大鼠血管平滑肌细胞增殖

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二、Egr-1特异诱骗寡核苷酸下调MMPs表达抑制原代培养的大鼠血管平滑肌细胞迁移

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

本研究创新性的自我评价

综述

参考文献

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