东北地区百合属植物种类鉴定及亲缘关系的RAPD分析

摘要

本实验对从东北地区收集到的15份百合属植物资源进行种类鉴定，经鉴定为9个种。应用正交设计和单因素试验相结合的方法对RAPD反应体系和反应程序进行了优化，建立了稳定高效的扩增体系，用RAPD扩增反应的结果对其亲缘关系进行分析，进一步明确了东北地区百合属植物的亲缘关系和分类。主要结论如下： 从东北地区收集到15份百合资源，对其茎、叶、花序、花等分类学性状进行调查和种类鉴定，将15份试材鉴定为9个种，其中细叶百合2份、有斑百合2份、大花百合1份、毛百合2份、朝鲜百合2份、大花卷丹2份、卷丹2份、垂花百合1份、东北百合1份。 建立了稳定的适用于百合的RAPD-PCR反应体系和反应程序。选择模板浓度、Mg2’浓度、dNTP浓度、引物浓度和Taq DNA聚合酶浓度5种因素，每种因素选定4个水平，进行正交设计L<,16>(4<'5>)，优化反应体系；再对以上5种因素设置不同的浓度梯度，进行单因素逐项优化。得到的最佳RAPD-PCR反应体系为：10xBuffer2μl、模板DNA2.0μl(40ng/μl)、Mg<'2+>2.0μl(25mmol/L)、dNTP1.2μl(10mmol/L)、引物2.0μl(20ng/μl)、Taq DNA聚合酶0.2μl(5U/μl)、H<,2>O 11.6μl。选择退火时间、延伸时间和循环次数3种因素，每种因素选定4个水平，进行正交设计L<,16>(4<'3>)，优化反应程序；再对以上3种因素和退火温度设置不同的梯度，进行单因素逐项优化。得到的最佳RAPD-PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30sec、39℃退火40sec、72℃延伸1 min，45个循环；72℃延伸10min。 应用RAPD最佳反应体系和反应程序对东北地区百合属植物9个种共15份资源进行扩增反应，并进行了亲缘关系聚类分析。从144个10碱基随机引物中筛选出带型理想的15个引物用于RAPD扩增，共扩增出256条带，多态性达87.5％。利用DPS软件对RAPD图谱记录数据进行聚类分析，得出欧氏距离矩阵及聚类分析树状图，不同种百合的亲缘关系可由树状图及欧氏距离显示出来，东北地区9种百合属植物可以被聚为三大类。首先不同产地的同种资源聚到一起；朝鲜百合与有斑百合、大花百合亲缘关系最近，东北百合(轮叶组)与其他组百合亲缘关系最远，传统形态分类系统中把叶序作为第一分类指标是可行的。卷瓣组的细叶百合、垂花百合、朝鲜百合与钟花组的有斑百合、大花百合聚为一类，卷瓣组的卷丹、大花卷丹与钟花组的毛百合聚为一类，说明卷瓣组与钟花组之间存在着基因交流。实验结果表明，RAPD能较好地反映百合之间的亲缘关系，与传统形态分类系统基本吻合。

目录

声明

前言

1材料与方法

1.1试验材料

1.2试验方法

1.2.1百合资源的种类鉴定

1.2.2 DNA样品的制备

1.2.3 DNA样品纯度和浓度的检测

1.2.4百合RAPD反应体系的优化

1.2.5百合RAPD反应程序的优化

1.2.6 RAPD-PCR扩增

1.2.7数据分析

2结果与分析

2.1百合资源的种类鉴定

2.2 DNA样品的制备

2.3百合RAPD反应体系的优化

2.3.1正交设计优化反应体系

2.3.2单因素逐项优化反应体系

2.4百合RAPD反应程序的优化

2.4.1正交设计优化反应程序

2.4.2单因素逐项优化反应程序

2.5 RAPD-PCR扩增

2.5.1不同引物的扩增效果

2.5.2 RAPD聚类分析

3讨论

3.1东北地区百合属植物种类鉴定与亲缘关系

3.2关于DNA的提取

3.3关于RAPD反应体系

3.3.1模板DNA浓度

3.3.2 Mg2+浓度

3.3.3 dNTP浓度

3.3.4引物浓度

3.3.5 Taq DNA聚合酶浓度

3.4关于RAPD反应程序

3.4.1变性的温度和时间

3.4.2复性的温度和时间

3.4.3延伸的温度和时间

3.4.4循环次数

3.5 RAPD反应体系和程序优化方案的比较

3.6 RAPD反应的稳定性及非技术影响

4结论

参考文献

致谢

攻读学位论文期间发表文章