HIF-1α氧依赖降解区域融合多肽对体外培养的皮质神经元缺氧的保护作用及机制的研究

摘要

前言
　　 缺氧缺血性脑病(Hypoxic-ischemic Encephalopathy,HIE)是由于各种围生期因素引起的缺氧和脑血流减少或暂停而导致胎儿和新生儿的脑损伤,临床出现一系列脑病表现,不仅严重威胁着新生儿的生命,而且是新生儿期后病残儿中最常见的病因之一,因此HIE的防治是当今全球范围内研究的热点问题。造成新生儿缺氧缺血性脑病的原因是多方面的,其中超过2/3发生在宫内,母体、胎盘及胎儿因素均可导致胎儿宫内缺氧缺血,中枢神经系统对缺氧缺血最为敏感,为减少缺氧缺血对胎儿脑组织的损害,新生儿缺氧缺血性脑病的防治要尽可能做到早预防、早发现、早诊断、早治疗。从胎儿医学的角度,HIE的防治应从宫内做起,近年来,胎儿宫内神经系统损伤及其防治越来越受到重视。是否可以通过在宫内给药达到早期进行脑保护性治疗是世界范围内倍受瞩目的课题。
　　 缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是细胞在缺氧条件下产生的具有转录活性的核蛋白,能够与靶基因相结合,通过转录及转录后的调控,使机体对缺氧、缺血产生适应反应。HIF-1的靶基因包括血管内皮生长因子(Vascularendothelial growth factor,VEGF)、葡萄糖载体蛋白-1(GLUT-1)、促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)、神经一氧化氮合酶、糖分解酶、亚铁血红素加氧酶等,参与血管形成、血管收缩反应、葡萄糖和能量代谢、红细胞生成、细胞增殖和分化、神经细胞凋亡等多种生理过程的调节,在缺氧缺血脑损伤后的血管生成、能量代谢的改善及抑制细胞凋亡中发挥着重要作用,是重要的神经细胞保护因子,能够有效的减轻新生儿缺氧缺血性脑病的损伤程度。对HIF-1在神经系统中的表达及调控的深入研究,有望为胎儿宫内缺氧缺血性脑损伤的防治提供一种新的途径。
　　 HIF-1主要由HIF-1α和HIF-1β以异源二聚体形式组成。其活性主要由HIF-1α亚单位调节。HIF-1α在氧含量正常的情况下,通过脯氨酸羟化酶区域(Prolylhydroxylase domain,PHD)酶使HIF-1α氧依赖的降解区域(ODD)的脯氨酸残基发生羟基化作用。羟基化的脯氨酸残基能被VHL蛋白(von Hippel-Lindauprotein,pVHL)的β区识别,形成泛素蛋白酶复合体。VHL蛋白是泛素连接酶复合体的组分之一,在蛋白因子的参与下,引导HIF-1α进入泛素.蛋白酶体途径降解,导致HIF-1失活,进而HIF-1靶基因转录被阻断。Willam等利用基因工程技术合成的HIF-1αODD融合多肽,常氧下能阻断HIF-1α的降解,引起HIF-1的聚积,诱导相关靶基因的转录,该融合多肽能指派HIF-1全部的生理反应,局部应用这些多肽能够诱导包括葡萄糖吸收和血管形成等多种复杂的生理学过程。因此这些多肽或基于它们的分子,是研究HIF-1介导的缺氧适应反应的有用工具,为缺氧缺血性疾病的治疗提供了一种新的思路。
　　 目的：
　　 为了研究HIF-1αODD融合多肽对神经元缺氧的保护作用,我们首先进行了新生大鼠原代皮质神经元的培养、鉴定,并制作了皮质神经元缺氧模型,观察了HIF-1αODD融合多肽对缺氧诱导的神经元凋亡的影响,并通过研究HIF-1αODD融合多肽对HIF-1α、PHD2和HIF1的靶基因VEGF表达的影响,深入探讨该融合多肽的作用机制,进一步证实其对缺氧诱导的神经元损伤的保护作用。探索HIF-1αODD融合多肽应用于宫内缺氧缺血的治疗的可能性,为胎儿宫内缺氧缺血性脑损伤开辟新的治疗途径。
　　 方法：
　　 1、新生大鼠皮质神经元培养、鉴定及缺氧模型的建立
　　 利用无血清培养技术进行新生大鼠皮质神经元的原代细胞培养;运用免疫荧光组织化学方法检测神经元特异性烯醇化酶进行神经元细胞的鉴定,检测体外培养的皮质神经元的纯度;运用厌氧培养箱建立神经元的缺氧模型。
　　 2、HIF-1αODD融合多肽降低缺氧诱导的神经元的凋亡
　　 以神经元对缺氧最为敏感的第0-8小时为研究的时间窗,应用CCK-8法检测正常对照组、缺氧对照组以及缺氧不同时间加入不同剂量HIF-1αODD融合多肽神经元细胞的生存率;应用DAPI染色法和原位末端标记法(TUNEL)法检测神经元缺氧不同时间的凋亡率。
　　 3、HIF-1αODD融合多肽对缺氧皮质神经元HIF-1α、VEGF和PHD2表达的影响
　　 利用免疫组织化学法和Western Blot方法检测正常对照组、缺氧对照组以及加入HIF-1αODD融合多肽治疗组神经元中HIF-1α、PHD2、VEGF蛋白水平的表达。利用Real time PCR检测正常对照组、缺氧对照组以及治疗组HIF-1α、PHD2、VEGF在神经元基因水平的表达。
　　 结果：
　　 1、新生大鼠皮质神经元培养、鉴定及缺氧模型的建立
　　 运用无血清培养技术成功培养了纯度95％以上的新生大鼠皮质神经元;运用神经元特异性烯醇化酶进行了神经元的鉴定;利用厌氧箱制备了神经元的缺氧模型。
　　 2、HIF-1αODD融合多肽降低缺氧诱导的神经元的凋亡
　　 在神经元缺氧敏感的0-8小时内,融合多肽能显著提高神经元的生存率,降低缺氧引起的神经元的凋亡,缺氧24小时前给药与缺氧即刻给药对神经元生存率的影响没有显著差别。
　　 3、HIF-1αODD融合多肽对缺氧皮质神经元HIF-1α、VEGF和PHD2表达的影响
　　 免疫组化学方法结果显示VEGF主要表达于神经元的细胞质中,HIF-1α和PHD2表达于神经元的细胞质与细胞核;Real time PCR及Western blot的结果显示HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白随着缺氧时间的延长逐渐增加,缺氧4小时达到高峰,随即逐渐下降,给予HIF-1αODD融合多肽能进一步提高HIF-1αmRNA及蛋白水平的表达;PHD2 mRNA及蛋白随着缺氧时间的增加逐渐增高,HIF-1αODD融合多肽显著提高了PHD2mRNA及蛋白的表达水平。
　　 结论：
　　 1、我们利用无血清培养技术成功培养出了高纯度的神经元,利用神经元特异性烯醇化酶为标志物进行了免疫荧光鉴定,并利用厌氧培养箱建立了神经元缺氧模型,该方法简单经济、可靠实用,有效的模拟了宫内缺氧环境,是研究体外皮质神经元缺氧及治疗的有效方法和手段,为进一步研究胎儿宫内缺氧奠定了基础。
　　 2、HIF-1αODD融合多肽能有效降低缺氧引起的体外培养的皮质神经元的凋亡,提高神经元的生存率,对神经元的缺氧损伤具有保护作用。
　　 3、HIF-1αODD融合多肽不仅增加HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白的表达也促进PHD2的转录,因此推测该多肽可能通过竞争性的抑制PHD2与HIF-1α氧依赖降解区域的结合,促进HIF-1α的稳定和表达增加,进而诱导相关靶基因如VEGF等基因的转录,上调HIF-1的低氧适应能力,从而发挥神经保护作用。