血必净对脂多糖及高糖作用下大鼠腹膜间皮细胞炎症因子表达的影响

摘要

腹膜透析是终末期肾脏病主要替代疗法之一。但在长期的腹膜透析过程中，不可避免地发生腹膜透析相关性腹膜炎，引起腹膜炎症细胞的浸润及腹膜细胞外基质的沉积，最终导致腹膜透析失败。脂多糖（lipopolysaceharide，LPS）是大肠杆菌的主要致病物质，是其唯一内毒素。LPS主要来源于长期腹膜透析引起的导管相关性感染，其次肠道内细菌可穿过通透性增高的肠壁进入腹腔。LPS和腹膜透析液中的高浓度葡萄糖是引起腹膜炎性改变和腹膜纤维化的主要原因。腹膜间皮细胞作为腹膜的主要构成细胞，是腹膜透析时与腹膜透析液接触的第一道生理屏障，是腹膜损伤反应的第一步。研究腹膜间皮细胞在LPS及高糖作用下的反应是研究腹膜损伤机制和干预腹膜损伤的基础。
　　 肿瘤坏死因子可启动IL-1等多种炎症因子的表达和分泌，是一种非常重要的早期炎症因子。高迁移率族蛋白-1（high mobility group box-1，HMGB-1）是新近发现的晚期炎症介质，参与了内毒素的致死效应。而LPS和TNF-α均可刺激HMGB-1的合成，HMGB-1反过来又可延迟激活体内单核/巨噬细胞等多种炎性细胞，引起TNF-α水平再度增高，二者相互诱生、相互促进，从而使炎症反应不断放大，持续加重组织损害。同时，HMGB-1的迁移性也是决定特定细胞坏死或凋亡的关键信号。转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）是一种多功能炎症活性因子，是直接联系腹膜炎与腹膜纤维化的关键因子。我们通过研究细菌脂多糖（lipoplysaccharide，LPS）对PMC分泌TNF-α、HMGB-1和TGF-β1的影响及三者之间可能存在的关系，进一步探讨腹膜炎的发生发展过程及其介导腹膜损伤和纤维化发生的可能机制。
　　 血必净是中药复方制剂，在治疗多种炎症及纤维化疾病中具有较好疗效。本研究通过观察血必净对脂多糖作用下大鼠腹膜间皮细胞TNF-α和HMGB-1表达的影响，探讨血必净能否通过抑制二者的表达，起到抑制炎症扩大、保护腹膜的作用。另外，我们还通过观察血必净对高糖诱导的PMC HMGB-1及TGF-β1表达的影响，明确血必净是否具有抑制高糖对PMC分泌细胞因子的作用，从而保护PMC，发挥潜在的抗腹膜纤维化作用。
　　 方法：
　　 1、实验用动物
　　 雄性SD大鼠（体重120-160g，清洁级，由中国医科大学实验动物中心提供）。
　　 2、胰蛋白酶消化法分离培养大鼠PMC，用RT-PCR法检测HMGB-1mRNA的表达，ELISA法测TNF-α、HMGB-1和TGF-β1蛋白表达。
　　 细胞分组：
　　 （1）不同浓度LPS组：0，1，10，100mg/L
　　 （2）10mg/L LPS作用不同时间组：0，2，6，12，18，21，24，36h
　　 （3）10mg/L LPS预孵育2h后，加入不同浓度血必净（2，10，20g/L）再作用4，22h
　　 （4）2.5％高糖作用不同时间组：0，18，24，36h.
　　 （5）2.5％高糖加入不同浓度血必净（2，10，20g/L）再作用18，24，36h
　　 结果：
　　 1、LPS对PMC HMGB-1表达的影响
　　 1mg/L LPS可使PMC的HMGB-1mRNA和蛋白质表达增加（P<0.05），100mg/L LPS作用最强（P<0.01）；10mg/L LPS作用18h后PMC的HMGB-1 mRNA和蛋白质表达增加（P<0.05），36h时表达达最大（P<0.01）。
　　 2、LPS对PMC TNF-α表达的影响
　　 1mg/L LPS可使PMC的TNF-α蛋白质表达增加（P<0.05），100mg/L LPS作用最强（P<0.01）；10mg/L LPS刺激PMC，TNF-α的含量在LPS刺激后2h开始增高并达峰值，6h到18h表达降低，于21h表达增高达另一峰值（P<0.05）。
　　 3、LPS对PMC TGF-β1表达的影响
　　 TGF-β1的含量在10mg/L LPS刺激后2h开始增高并达峰值，6h降低，12h开始增高并持续至36h（P<0.05）。
　　 4、血必净对LPS作用下PMC HMGB-1表达的影响
　　 10g/L血必净可抑制经10mg/L LPS预孵育2h后的PMC HMGB-1mRNA表达（P<0.05）；2g/L血必净可抑制10mg/L LPS预孵育2h后的PMC HMGB-1蛋白质表达（P<0.05），20g/L血必净的这种抑制作用最强（P<0.01）。
　　 5、血必净对LPS作用下PMC的TNF-α蛋白表达的影响
　　 2g/L血必净可抑制10mg/L LPS预孵育2h后的PMC TNF-α蛋白的表达（P<0.05），20g/L血必净组的抑制作用更强（P<0.01）。
　　 6、高糖对PMC的HMGB-1和TGF-β1表达的影响
　　 2.5％高糖作用18h后PMC的HMGB-1和TGF-β1表达增加（P<0.05），作用36h后二者表达达最大（P<0.01）。
　　 7、血必净对高糖作用下PMC的HMGB-1和TGF-β1表达的影响
　　 加血必净的葡萄糖组HMGB-1及TGF-β1的含量均显著低于高糖组（P<0.05），且随着血必净浓度升高，HMGB-1及TGF-β1的含量下降，20g/L血必净组两者含量最低。
　　 结论：
　　 1、HMGB-1作为晚期炎症因子参与了腹膜透析相关性腹膜炎的病理过程，LPS通过上调TNF-α、HMGB-1和TGF-β1的表达，引起持续放大的炎症反应损伤腹膜并导致腹膜纤维化。
　　 2、血必净可明显下调TNF-α及HMGB-1的表达，减轻腹膜炎症损伤。
　　 3、高浓度葡萄糖可促进PMC表达HMGB-1和TGF-β1，而血必净可以拮抗高糖对PMC HMGB-1和TGF-β1表达的上调作用，提示血必净对预防、延缓腹膜纤维化有一定意义。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略语

第一部分

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

参考文献

在学期间科研成绩

致谢

个人简历