Cb1-b调节RANKL/RANK通路介导的乳腺癌细胞迁移的机制研究

摘要

目的：
　　 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。在我国,乳腺癌发病率正以每年3％的速度递增,是发病率增长最快的肿瘤。骨是乳腺癌最常见的转移部位,晚期乳腺癌患者约65％-75％将发生骨转移。乳腺癌骨转移导致骨痛、骨折等骨相关事件,严重影响患者的生活质量。但是,迄今为止,临床上对乳腺癌骨转移的预防尚无有效的方法,主要是因其机制还未明确。因此,研究乳腺癌骨转移机制对认识乳腺癌生物学性质和研发新的分子靶向药物具有重要意义。
　　 研究证实,细胞核因子kB受体活化因子配体RANKL(receptor activator ofNFkB Ligand;又名TRANCE)具有很强的趋化因子样作用。RANKL是肿瘤坏死因子家族成员,通常表达于成骨细胞/骨基质细胞表面,其受体RANK表达于破骨细胞表面。RANKL与RANK结合后,促进破骨细胞的活化。最新研究发现,RANK在恶性黑色素瘤细胞和乳腺癌细胞表面也过表达。RANKL使RANK表达阳性的恶性黑色素瘤细胞和乳腺癌细胞的迁移功能增强。动物实验证实,RANKL使RANK表达阳性的恶性黑色素瘤细胞的骨转移能力明显增强。但RANKL对RANK表达阴性的肠癌细胞的迁移功能和骨转移能力并无影响。上述结果强烈提示,RANKL/RANK通路在乳腺癌骨转移中可能发挥重要作用。
　　 关于RANKL/RANK信号传导通路,国外研究证实:RANKL与RANK结合后,活化的RANK与TRAFs和Gab2(Grb2相关结合蛋白2)等形成蛋白复合体,该复合体协同酪氨酸蛋白激酶Syk激活下游的Rac、MAPKs和PI3K等信号通路,促进破骨细胞的迁移及活化,同时,C-src与FAK也参与破骨细胞的成熟与分化,而文献报道,Gab2,C-src与FAK均与乳腺癌的增殖、粘附、迁移等密切相关。但是在RANKL诱导的乳腺癌细胞迁移过程中,Gab2,c-src与FAK是否也存在活化而发挥作用,尚无文献报道。
　　 RANKL/RANK通路受泛素-蛋白酶体通路的负调控,泛素-蛋白酶体通路的精确调控依赖于三种酶的参与,Cbl-b为其中的泛素连接酶,可以特异性地识别需要降解的底物蛋白。国外研究证实破骨细胞当受到RANKL的刺激后,Cbl-b与RANK及Gab2结合,诱导其发生泛素化降解。综合文献报道,我们提出如下假说:RANKL/RANK通路是导致乳腺癌骨转移的关键因素;Cbl-b通过诱导RANKL/RANK通路重要分子的泛素化及降解抑制乳腺癌骨转移。
　　 本研究以人乳腺癌细胞系MDA-MB-231为模型,研究RANKL/RANK通路促进乳腺癌细胞迁移的机制,探讨Cbl-b在此过程中的作用,并进一步通过检测乳腺癌患者术后癌组织Cbl-b与RANK的表达,分析其与骨转移发生、预后的关系来验证Cbl-b对RANKL/RANK通路的调控作用。
　　 材料和方法：
　　 1、流式细胞仪检测细胞表面受体蛋白的表达。
　　 2、Transwell趋化小室法测定细胞迁移能力。
　　 3、Western blot检测蛋白表达。
　　 4、免疫共沉降检测蛋白间的共结合。
　　 5、统计学处理:每次实验重复3次,数据以Mean±S.D.表示,采用SPSS13.0软件进行t检验。P＜0.05有统计学意义。
　　 6、Spearman等级相关法检验不同观察指标间的相关性。采用log-rank检验及Kaplan-meier曲线比较、描述PFS及OS。
　　 结果：
　　 一、RANKL促进乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移
　　 (一)Transwell趋化小室法显示RANKL(2μg/ml)诱导MDA-MB-231细胞迁移增加,迁移指数为1.7。RANKL诱导的MDA-MB-231细胞迁移可被RANKL的竞争性抑制剂OPG(10μg/ml)阻断。
　　 (二)RANKL(2μg/ml)刺激MDA-MB-231细胞30分钟后p-ERK表达升高,MEK/ERK通路抑制剂PD98059(25μM)明显抑制RANKL诱导的细胞迁移。
　　 (三)RANKL(2μg/ml)刺激MDA-MB-231细胞30分钟后,p-AKT表达升高,PI3K/AKT通路抑制剂LY294002(50μM)明显抑制RANKL诱导的细胞迁移。
　　 (四)RANKL(2μg/ml)刺激MDA-MB-231细胞5分钟后p-Src水平升高,Src家族激酶抑制剂PP2(10μM)显著抑制RANKL诱导的细胞迁移。
　　 (五)RANKL(2μg/ml)刺激MDA-MB-231细胞5分钟后p-FAK及p-Gab2水平升高。
　　 (六)RANKL(2μg/ml)及Src抑制剂PP2(10μM)同时处理MDA-MB-231细胞30分钟后,p-FAK及p-AKT水平被抑制而p-ERK的活化不受影响。
　　 二、泛素连接酶cbl-b调控RANKL诱导的乳腺癌细胞迁移
　　 (一)RANKL(2μg/ml)诱导的细胞迁移过程中,Western blot检测cbl-b的表达无明显变化。
　　 (二)泛素蛋白酶体抑制剂硼替佐米(PS341)(10nM)预处理4小时抑制Cbl-b的功能后,RANKL诱导的乳腺癌细胞迁移增加(迁移指数:PS341+RANKLv RANKL:2.6±0.3 v1.6±0.5,p＜0.05)。
　　 (三)免疫共沉降检测Cbl-b与RANKL/RANK通路上游信号蛋白FAK、Gab2及C-Src存在共结合。
　　 三、RANK及cbl-b在乳腺癌表达及与临床病理特征之间关系的研究
　　 (一)RANK和Cbl-b表达的阳性率分别为53.1％和55.5％,RANK与Cbl-b之间的表达成正相关(r=0.324,P＜0.001);Cbl-b表达强弱与组织学分级呈负相关(r=-0.275,p=0.009)。分层分析显示RANK阳性组患者中,Cbl-b的表达强弱与远期转移呈负相关(r=-0.157,p=0.04),与淋巴结转移(术中加远期)成负相关(cc=-0.186,p=0.021),与骨转移无明显相关。
　　 (二)总人群中,RANK表达阳性和阴性的患者的PFS(p=0.817)及OS(p=0.099)无差异,但分层分析结果显示:在发生远期转移的患者中(67例)RANK表达的患者的总生存及无进展生存短于RANK阴性的患者,具有显著的统计学差异(PFS:p=0.031;OS:p=0.017);而在发生远期骨转移的患者中,RANK表达的患者骨转移发生更早,生存更短。中位无骨转生存:RANK阴性组v阳性组=67±3 v32±7month(p=0.009);中位生存:RANK阴性组v阳性组=67±3v32±7month(p=0.017)。
　　 (三)总人群中,Cbl-b表达阳性和阴性的患者的PFS(p=0.444)及OS(p=0.254)无差异,但分层分析结果显示:RANK阳性患者中,表达Cbl-b的患者PFS(p=0.046)及OS(p=0.051)较长,而RANK阴性的患者中Cbl-b表达与否不影响患者的PFS(p=0.46)和OS(p=0.649)。
　　 结论：
　　 1、RANKL诱导表达RANK的MDA-MB-231细胞迁移能力增强。
　　 2、MEK/ERK及PI3K/AKT信号通路参与RANKL诱导的乳腺癌细胞迁移。
　　 3、C-src、FAK及Gab2参与RANKL诱导的乳腺癌细胞迁移。
　　 4、RANKL诱导的乳腺癌细胞迁移过程中,Src激酶抑制剂PP2抑制PI3K/AKT而非MEK/ERK的活化。
　　 5、Cbl-b在RANKL诱导的乳腺癌细胞迁移过程中表达无变化,但抑制Cbl-b的功能使RANKL诱导的乳腺癌细胞迁移增加。
　　 7、Cbl-b与RANKL/RANK通路上游信号蛋白FAK,Src,Gab2共结合。
　　 8、RANK表达影响乳腺癌患者晚期转移尤其是骨转移的预后。
　　 9、Cbl-b通过负调控RANKL/RANK通路影响乳腺癌患者远处转移的发生及预后。