利用OWLS研究二级结构对固液界面DNA杂交动力学的影响

摘要

目的：
　　 基因芯片技术自上世纪末诞生以来，取得迅速发展，并已广泛应用到了基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、遗传病相关基因分析、药物筛选、基因测序、基因调控网络分析等多个领域。尽管所有的基因芯片都是基于DNA链的杂交，但这种设计间的不同却产生了较大结果差异。由于基因芯片复杂性较高，使得基因芯片的重复性差、特异性不高。
　　 OWLS(Optical Waveguide Lightmode Spectroscopy)提供了一个可调温度的杂交平台，并能不断补充杂交损耗的靶序列分子，保证杂交液中靶序列浓度稳定。且OWLS采用非标记的检测方法，连续检测杂交信号强度，避免引入其他因素干扰杂交结果。另外，OWLS的传感器芯片与国内外生产的基因芯片的片基一致，保证了我们实验结果的可信性。
　　 本研究的目的是利用OWLS分析探针和靶序列的二级结构以及探针和靶序列之间的错配对基因芯片杂交过程的影响。进而完善基因芯片设计方法，提高基因芯片的重复性。
　　 方法：
　　 1、软件设计
　　 设计3对具有不同二级结构的探针及靶序列，并用Mfold软件分析其二级结构。
　　 2、荧光标记法确定最佳杂交浓度
　　 探针浓度的选择
　　 分别将不同浓度的探针固定于芯片表面后，用5μMCy5标记的靶序列进行杂交1h后检测荧光信号强度。
　　 靶序列浓度的选择
　　 用10μM的探针构建芯片后，分别用不同浓度的Cy5标记的靶序列进行杂交1h后检测荧光信号强度。
　　 3、化学法再生传感器芯片
　　 分别用0.4％SDS和0.1％NaOH处理杂交后的传感器芯片，再杂交后检测荧光信号强度。
　　 4、光波导模式谱法(OWLS)监测传感器芯片
　　 靶序列与固定在芯片表面的探针分别进行短时间杂交(0.5h)及完全杂交(大于7h)后，用OWLS检测传感器芯片表面探针结合靶序列的质量变化。
　　 结果：
　　 1、探针及靶序列的二级结构
　　 应用Mfold软件成功预测3对探针及靶序列的二级结构。在37℃条件下，一对探针及靶序列无固定二级结构；另一对形成较少的茎环结构；第三对形成较多的茎环结构。
　　 2、最佳杂交条件
　　 探针的浓度确定为10μM;靶序列的浓度确定为1μM。
　　 3、传感器芯片的最佳再生条件
　　 0.1％NaOH处理芯片0.5h可有效地使传感器芯片再生。该芯片反复杂交5次后，荧光信号强度没有明显变化，表明传感器芯片具有再生稳定性。
　　 4、形成杂交复合物的质量与速率常数
　　 短时间杂交后，具有不同二级结构的探针及靶序列在传感器芯片表面形成复合物的质量有明显差异，而经完全杂交后，形成复合物的质量没有明显差异，但随着二级结构的增加，杂交速率降低。
　　 结论：
　　 探针与靶序列完全杂交后，探针和靶序列的二级结构不会影响最终在芯片表面形成复合物的质量。保证其他杂交条件不变，在一定时间内，随着的二级结构的增多，杂交所需要的时间延长，杂交速率和效率都降低。而随着二级结构的减少，杂交所需要的时间缩短，杂交速率和效率都升高。尾部的2个碱基的错配对杂交的速率和效率的影响并不明显。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略语

论文 利用OWLS研究二级结构对固液界面DNA杂交动力学的影响

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

四、本研究创新性的自我评价

五、参考文献

综述 靶序列结构对基因芯片杂交动力学影响的研究进展

参考文献

致谢

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