Rho/ROCK信号通路对高糖诱导下人肾小球系膜细胞炎症反应及纤维化的影响

摘要

糖尿病肾病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病(Diabetes mellitus，DM)重要的微血管并发症之一，是终末期肾病(End-stage renal disease，ESRD)的主要原因，成为DM患者死亡的主要原因之一，其主要病理学特征是肾小球基底膜的增厚和系膜基质的增多，而高血糖是导致DKD发病的一个主要原因1]。近年来研究发现小G蛋白/小G蛋白激酶(Rho/ROCK)信号通路与多种组织重构如血管、心肌、肾脏纤维化等相关[2]，高糖能够刺激肾脏细胞内Rho/ROCK信号通路的激活，后者通过调控转录因子的DNA结合活性上调多种基因表达，包括细胞外基质(extracellular matrix，ECM)如Ⅰ、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白(FN)和层粘连蛋白( LN)等，从而引起各种炎症反应（如肿瘤坏死因子tumor necrosis factor alpha TNF-α等炎症因子的增加）及肾小球纤维化（如结缔组织生长因子concentration of connective tissue growth factor CTGF浓度的增加）[3]。
　　 目的:
　　 探讨Rho/ROCK信号通路在高糖诱导的人肾小球系膜细胞(Human mesangialcells，HMC)炎症反应及纤维化中的作用。
　　 方法:
　　 将传代培养的HMC同步化后分为8组：
　　 (1)正常糖浓度对照组(NG，含葡萄糖5.5mmol/L)；
　　 (2)高糖组(HG，含葡萄糖30mmol/L)；
　　 (3)甘露醇渗透压对照组（Man，含5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇）；
　　 (4)正常糖+Y-27632组(NG+Y-27632，浓度10μmmol/L):
　　 (5)高糖+Y-27632组(HG+Y-27632，浓度10μmmol/L):
　　 (6)高糖+fasudil-25组(HG+F25，含法舒地尔25μmmol/L);
　　 (7)高糖+fasudil-50组(HG+F50，含法舒地尔50μmmol/L)；
　　 (8)高糖+fasudil-100组(HG+F100，含法舒地尔100μmmol/L)，培养12、24、36、48、72h后收集上清及细胞，用Western blot检测RhoA蛋白的活化，用Real-time RT-PCR检测细胞中RhoA，ROCK-Ⅰ，CTGF，TNF-α mRNA浓度的变化，用ELISA方法检测上清中FN，CTGF，TNF-α的蛋白含量。
　　 结果:
　　 1、高糖刺激HMC能诱导RhoA活化，于30min即可出现活性升高，th达到高峰，之后活化RhoA的表达逐渐下降(P=0.02)。
　　 2、高糖培养下的HMC RhoA，ROCK-Ⅰ，CTGF，TNF-α mRNA的表达较NG组明显升高（P＜0.05），并有一定的时间依赖性，Man组与NG组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　 3、经Y-27632预处理后，在正常糖和高糖浓度培养24h或48h后，NG+Y-27632组和HG+Y-27632组与未处理组相比RhoA，ROCK-Ⅰ，CTGF，TNF-α mRNA的表达明显下降(P＜0.01)。
　　 4、高糖条件下，经不同浓度Fasudil预处理后，高糖浓度继续培养24h或48h，HG+Fasudil组与HG组对比，RhoA，ROCK-Ⅰ，CTGF mRNA的表达明显下降(P＜o．05），并有一定的浓度依赖性。
　　 5、高糖呈时间依赖方式增加HMC对FN，CTGF，TNF-α蛋白的分泌(P＜0.05)，而NG组和Man组无此作用（P＞0.05）。
　　 6、经Y-27632预处理，继续培养12h，24h，36h，48h，72h后NG组和HG组中FN，CTGF，TNF-α蛋白的分泌较处理前明显降低（P＜0.05）。
　　 7、经不同浓度Fasudil预处理后，高糖继续培养12、24、36、48、72h后FN，CTGF，TNF-α蛋白的分泌较HG组明显降低(P＜0.05）。
　　 结论:
　　 1、高糖能够上调HMC中活性RhoA的表达，从而激活Rho/ROCK信号转导通路，进而使该通路下游的ROCK-Ⅰ、及细胞外基质成分(FN)、致纤维化因子(CTGF)及致炎因子(TNF-α)的表达增加；
　　 2、采用Rho/ROCK通路的选择性抑制剂Y-27632和法舒地尔抑制RhoA的表达，可减少高糖刺激下系膜细胞ROCK-Ⅰ、FN、CTGF、TNF-α的积聚，从而可减少肾小球的纤维化和炎症反应。

目录

文摘

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英文缩略语

论文 Pho/ROCK信号通路对高糖诱导下人肾小球系膜细胞 炎症反应及纤维化的影响

前言

材料与方法

实验结果

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结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 Rho/ROCK信号通路参与糖尿病肾病发生机制的研究进展

参考文献

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