死亡受体介导的Caspase依赖性肺泡巨噬细胞凋亡在矽肺发生发展中的作用研究

摘要

目的:
　　 尘肺(pneumoconiosis)是生产过程中长期吸入含游离SiO2粉尘引起的以肺组织纤维化为主的全身性疾病,是全球分布范围最广、患病人数最多、不能治愈但完全可以预防和控制的职业病。我国是目前世界上受生产性粉尘影响最为严重的国家之一,粉尘暴露工人已超过2000万。虽然采取了相应的预防控制措施,但尘肺发病形势依然严峻。近10年我国每年新发尘肺病例1-2万,而且尘肺病有发病工龄缩短、发病年龄提前的趋势。因此,研究尘肺发病的深层次机制依然是该领域的热点话题。
　　 矽肺是尘肺中危害最严重的一种。动物实验研究表明,SiO2进入肺泡后,肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)发生聚集,吞噬尘粒后被活化,合成并释放大量具有多种生物活性的细胞因子、前炎症因子、趋化因子和蛋白酶类,进而引起Ams功能改变、崩解死亡和肺泡结构改变及其他细胞受损破坏,导致弥漫性肺间质纤维化。但矽尘诱发Ams死亡的确切机制目前尚不清楚。
　　 近年研究发现,SiO2引起肺纤维化的过程中,肺细胞凋亡被认为是形成肺泡炎导致肺纤维化的病理学基础。体外试验及动物实验研究表明,吸入肺泡的SiO2颗粒被Ams吞噬的过程中与Ams表面的清除剂受体(scavenger receptor,SR)相互作用,或通过SiO2颗粒表面的微生物配体与SR相互结合激活Ams,上调促细胞凋亡基因如细胞膜死亡受体Fas(CD95/APO-1)及抑癌基因bax等的表达。Ams被激活后,部分产生天冬半胱氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate specificprotease,Caspase)依赖性凋亡,同时释放细胞因子IL-1、IL-8、TNF-α、花生四烯酸代谢产物等,募集中性粒细胞,引发巨噬细胞性肺泡炎,并进而导致肺泡壁结构破坏,引起肺组织纤维化。
　　 凋亡的发生有赖于内源性或外源性刺激诱发凋亡信号通路的激活以及信号传递和凋亡的执行。外源性刺激主要通过死亡受体通路将细胞外信号传递至细胞内,内部信号由存在于线粒体和内质网内部的凋亡信号引发,两种信号通路共享Caspase瀑布效应机制从而介导细胞凋亡。体外及动物实验表明,死亡受体介导的肺细胞凋亡在肺纤维化起重要作用。但到目前为止,有关死亡受体(death receptor,DR)、Ams凋亡、炎症及凋亡有关的细胞因子在矽肺发生发展中的作用研究仅限于体外试验和动物实验,为此本研究以矽肺患者为研究对象,收集其大容量肺灌洗回收液中Ams,研究AM凋亡、细胞因子、死亡受体表达水平及其在矽肺发生发展中的作用,以期为矽肺的预防和控制提供科学依据。
　　 研究方法:
　　 一、研究对象的选择
　　 以中国煤矿工人北戴河疗养院收治的无其他肺部疾病的61例年龄32-64岁、接尘工龄1-37年的汉族男性观察对象及矽肺患者为观察组,以4例误吸异物的非接尘汉族健康男性、9例接尘工龄不足3月、肺部X线表现完全正常的汉族男性为对照进行研究。矽肺病诊断由当地尘肺病诊断小组根据我国《尘肺病诊断标准》(GBZ70-2009)进行诊断。所有研究对象均排除与肺部相关的疾病(如肺炎、肺癌、活动性肺结核等)及有尘肺并发症、严重心、肝、肾疾患以致不能进行肺灌洗者。所有纳入研究者肺灌洗前签署知情同意书。
　　 二、研究内容和方法
　　 1、基本信息调查
　　 根据课题研究目的设计合理的调查表,调查工作由本人直接负责,调查采用面对面问卷式,调查研究对象的一般情况、职业史、接尘史、疾病史等。职业史资料来自肺灌洗者所在单位的劳资部门或职业病管理部门,尘肺诊断、肺灌洗情况以及肺部并发症的资料来自北戴河疗养院专科医院的住院病案。
　　 2、DR、Caspase及细胞因子检测
　　 所有研究对象签署肺灌洗知情同意书后,全麻下实施大容量肺灌洗,收集肺灌沈回收液,双层无菌纱布过滤除去粘液后,离心,用PBS洗涤三次,细胞计数。取5×106AMs加入盛有DMEM培养基的六孔培养板中,37℃贴壁培养2h,更换培养基后,继续培养24h,留取上清,收获细胞,采用Western Blotting测定膜结合型死亡受体mFas、mTNFR1、mTRAILR2及Caspase-8、Caspase-3的表达,X光胶片用Mixrotek ScanWizard5扫描软件进行电脑扫描、Quantity one7.0图像分析软件做灰度分析,检测条带的平均光强度,计算其相对表达量。采用抗人的ELISA试剂盒测定AM培养上清中可溶性死亡受体sFas、sTNFR1、sTRAILR2以及炎性细胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1、MIP-1α、TGF-β1的表达水平。
　　 3、Ams凋亡程度检测
　　 AM培养24h后,分别采用普通光学显微镜(HE染色)、透射电子显微镜、激光共聚焦显微镜(Hoechst33258及抗人-CD68-FITC染色)观察凋亡Ams的形态特征,采用流式细胞仪(PI染色)、TUNEL及琼脂糖凝胶电泳方法检测凋亡Ams的生化特征,并进行凋亡程度的定量。
　　 4、死亡受体信号通路对Ams凋亡及炎性细胞因子表达的调控分析
　　 将9例正常对照和18例壹期矽肺的Ams纯化后,按照三条死亡受体信号通路进行分组处理,Fas/FasL/FLICE信号通路分为5个处理组,即未处理组、Fas通路组(控制其他两条信号通路),SOD复合酶组、抗-FasL组、Caspase-8抑制剂组;TNF-α/TNFR/NF-κB通路分为6个处理组,即未处理组、TNF通路组(控制其他两条信号通路),SOD复合酶组、抗-TNF-α组、Caspase-8抑制剂组、NF-κB抑制剂组;TRAIL/TRAILR通路分为5组,即未处理组、TRAIL通路组(控制其他两条信号通路),SOD复合酶组、抗-TRAIL组、Caspase-8抑制剂组。加入不同抑制剂培养24h后,留取上清,收获细胞,分别采用琼脂糖凝胶电泳及流式细胞仪检测Ams的凋亡情况,采用Western blotting及ELISA检测Ams裂解液中死亡受体的表达及培养上清中Ams炎性因子的表达水平。
　　 5、统计分析方法
　　 资料整理后,用Excel建立数据库,用STATA10.0软件进行统计分析,分别采用t检验、方差分析、Kruskal-Wallis秩和检验、Spearman相关分析、最优尺度回归及逐步回归分析等方法,分析不同期别矽肺患者死亡受体、Ams凋亡指数、炎性细胞因子表达水平的差异;死亡受体、Ams凋亡指数、Ams炎性因子表达水平与矽尘暴露的关系;死亡受体表达水平与Ams凋亡的关联、Ams凋亡与培养上清中6种Ams炎性因子表达水平的关联;不同抑制剂对各条死亡受体信号通路的阻断效果。
　　 结果:
　　 一、不同期别矽肺患者Ams凋亡情况、死亡受体及炎性细胞因子表达水平
　　 (一)不同期别矽肺患者Ams凋亡情况
　　 普通光镜下、透射电镜及激光共聚焦显微镜下,可见正常Ams细胞膜及核膜完整,染色质分布均匀,线粒体及内质网正常,大量溶酶以及吞噬的粉尘颗粒。凋亡Ams体积变小,细胞质浓缩,内质网与线粒体密集,线粒体肿胀,嵴消失;细胞膜微绒毛消失、起泡、出芽;核膜断裂;细胞染色质浓缩、边缘化、碎裂成团块,形成凋亡小体;染色质边缘化,呈戒指样或猫眼状;溶酶体自噬体在纤维化早期形成活跃。且发现随着肺部纤维化程度的逐渐加重,凋亡Ams数量随之增多,Ams核染色质的形态变化也加重。琼脂糖凝胶电泳可见壹期矽肺患者Ams的基因组DNA出现了凋亡细胞特征性的阶梯状(ladder pattern)的电泳条带,电泳条带的间距在200bp左右及其整倍数。TUNEL染色显示,凋亡Ams中有棕黄色颗粒。在流式散点图上可见Ams纯化前后PI的荧光强度随前向和侧向散射光而增大,纯化后则较纯化前减弱,说明巨噬细胞大小不一致,而且细胞内存在颗粒物。在流式直方图中可见正常二倍体峰(G0/G1)之前出现了典型的亚二倍体凋亡峰,且峰高随肺纤维化程度的加重而增高。经定量,矽肺患者的Ams凋亡指数高于观察对象(18.6±2.9)％和正常对照(19.6±9.6)％,且随肺纤维化程度的加重,Ams凋亡程度有增加的趋势[壹、贰、叁期矽肺患者凋亡指数分别为(31.8±6.2)％、(43.6±7.9)％和(65.4±16.4)％,P＜0.05]。
　　 (二)不同期别矽肺患者死亡受体及Caspase的表达情况
　　 本研究发现,接触矽尘者三种膜结合型死亡受体蛋白条带灰度均较对照者深,且随着肺部纤维化病变程度的加重而加深;定量分析表明,接触矽尘者三种膜结合型死亡受体水平均高于正常对照,矽肺患者三种mDR水平均高于观察对象,且随着肺纤维化程度的加重而升高。正常对照与观察对象膜结合型死亡受体水平的差异无统计学意义;矽肺患者AM培养上清中三种可溶性死亡受体水平均高于观察对象,贰、叁期矽肺患者三种可溶性死亡受体水平均低于壹期(P＜0.05)。矽尘接触者Caspase-8及Caspase-3的蛋白条带灰度较正常对照深,随着肺部纤维化程度的加重,蛋白条带灰度逐渐加深。半定量分析表明,接触矽尘者Caspase-8及Caspase-3水平高于正常对照,矽肺患者Caspase-8及Caspase-3表达水平高于观察对象,且均随肺纤维化程度的加重而增高,其变化趋势与AM凋亡指数的变化一致。
　　 (三)不同期别矽肺患者AM培养上清中炎性因子表达水平
　　 矽肺患者AM培养上清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、IL-8及MCP-1水平均高于观察对象(P＜0.05),贰期以上患者TNF-α、MCP-1的表达水平高于壹期,TGF-β1则低于壹期患者,差异有统计学意义.
　　 二、矽肺患者AM凋亡情况、死亡受体及炎性细胞因子表达水平影响因素分析
　　 (一)矽肺患者AM凋亡情况及影响因素分析
　　 矽肺患者.AM凋亡程度随着三种膜结合型死亡受体及Caspase-3的表达水平的升高而逐渐增加;发病工龄＜15年、工龄＜20年、发病年龄＜45岁、持续暴露于粉尘作业环境者AM凋亡指数高于发病工龄≥15年、工龄≥20年、发病年龄≥45岁、脱离粉尘作业环境者;未发现AM凋亡与年龄、开始接尘年龄及吸烟的关系。年龄＜45岁、发病年龄＜45岁、发病工龄＜15年、开始接尘年龄≥25岁、脱离矽尘作业者Caspase-8的表达水平较高;年龄＜45岁、发病工龄＜15年者Caspase-3的表达水平越高。AM凋亡指数及Caspase-3表达水平与发病年龄呈负相关;Caspase-8的表达水平与年龄、工龄及发病年龄均呈负相关。AM凋亡程度随着矽肺期别的增高、三种死亡受体及Caspase-3表达水平的升高而增加,随着发病年龄的增大及脱尘年限的延长而降低。
　　 多因素分析表明,发病工龄、mFas、Caspase-8、caspase-3及吸烟与AM凋亡指数的关系依然存在,这些变量共同解释了方程总变异的87.95％,其中,Caspase-3解释了方程总变异的44.36％,Caspase-8解释了方程总变异的18.27％,mFas和mTRAILR2解释了方程总变异的9.74％,接尘工龄、发病工龄及脱尘年限共同解释了方程总变异的8.28％。
　　 (二)矽肺患者死亡受体表达水平的影响因素分析
　　 分析表明,发病年龄＜45岁组mFas水平高于45岁以上组;发病工龄＜15年者mFas水平高于15年以上者;工龄＜20年组mTNFR1水平高于20年以上者;持续接尘者mTRAILR2水平高于脱离粉尘作业环境者;mFas与发病年龄呈负相关,mTRAILR2与年龄、发病年龄、脱尘年限均呈负相关。接尘工龄＜20年、脱尘者sFas水平高于接尘工龄≥20年、持续接尘者;发病年龄＜45岁、发病工龄＜15年者sTNFR1水平低于发病年龄≥45岁、发病工龄≥15年者;发病年龄＜45岁、接尘工龄＜20年、发病工龄≥15年及脱尘者sTRAILR2的水平较低。表7表明,sTNFR1表达水平与年龄呈正相关,sTRAILR2表达水平与发病年龄呈正相关。
　　 (三)矽肺患者AM培养上清中炎性因子表达水平的影响因素分析
　　 分析发现,不脱离矽尘作业者IL-1β、TGF-β和MIP-1α的表达水平高于脱离矽尘作业者,TNF-α则呈相反的趋势;发病工龄＜15年者IL-1β表达水平低于发病工龄≥15年者;MCP-1的表达水平则呈相反的趋势;IL-1β、TNF-α及MCP-1表达水平均与脱尘年限呈负相关。
　　 三、死亡受体信号通路对AM凋亡及AM培养上清中炎性因子表达的调控作用
　　 (一)Fas/FasL/FLICE信号通路对AM凋亡及AM培养上清中炎性因子表达的调控作用
　　 本研究发现,经不同抑制剂阻断信号转导后,Fas、FasL、Caspase-8及Caspase-3的条带灰度均较未处理组浅;各处理组mFas、Caspase-8均低于未处理组,Caspase-3与NF-κB P50的表达水平除Fas/FasL通路组外均低于未处理组;DNA片段化程度均较未处理组减轻,以SOD复合酶的阻断效果最佳,其次是抗-FasL抗体;AM凋亡指数均低于未处理组,也以SOD复合酶的阻断效果最佳;不同处理组AM培养上清中除TNF-α外,IL-8、MCP-1、MIP-1α及TGF-β1的表达水平均有不同程度的下降。
　　 (二)TNF-α/TNFR/NF-κB信号通路对AM凋亡及AM培养上清中炎性因子表达的调控作用
　　 本研究显示,经不同抑制剂阻断死亡信号传导后,可溶性及膜结合型TNF-α、TNFR1/2、Caspase-8、Caspase-3及NF-κBP65/P50的蛋白条带灰度均低于未处理组;AM裂解液中mTNFR1、Caspase-8、Caspase-3及NF-κB P50的表达水平均低于未处理组;用NF-κB抑制剂TPCK阻断信号通路后,上述信号分子的蛋白条带灰度虽低于未处理组,但均高于其他处理组;定量分析发现mTNFR1的表达水平虽低于未处理组,但均高于其他处理组,Caspase-8、Caspase-3及NF-κB P50的表达水平均低于未处理组;除NF-κB抑制剂组DNA片段化程度增强外,其他各处理组DNA片段化程度均减轻;AM凋亡指数均较未处理组降低,但NF-κB抑制剂TPCP阻断信号转导后,AM凋亡指数几乎与未处理组一致;AM培养上清中IL-1β、I1-8、TNF-α、MCP-1、MIP-1α、TGF-β1均有不同程度的下降,而用NF-κB抑制剂TPCP阻断信号转导后,这6种细胞因子的表达水平则稍微降低或者反而升高。
　　 (三)TRAIL/TRAILR信号通路对AM凋亡及AM培养上清中炎性因子表达的调控作用
　　 本研究揭示,不同信号通路抑制剂在不同环节阻断死亡信号转导后,mTRAILR2、mTRAIL、Caspase-8、Caspase-3的蛋白条带灰度均较未处理组浅;ELISA分析表明,经各种抑制剂阻断信号通路后,mTRAILR2、Caspase-8、Caspase-3及NF-κBP50的表达水平均较未处理组下降;琼脂糖凝胶电泳显示,经各种抑制剂阻断信号通路后,DNA片段化程度均较未处理组减轻;AM凋亡指数均较未处理组下降,以SOD复合酶组下降最为明显;AM培养上清中IL-1β、IL-8、MCP-1、MIP-1α水平多数较未处理组下降。
　　 结论:
　　 1、矽肺患者AM膜结合型死亡受体水平高于观察对象及健康对照,且随着肺部纤维化程度的加重而升高,与年龄、发病年龄及脱尘年限呈负相关;矽肺患者可溶性死亡受体水平低于观察对象,且随肺部纤维化程度加重而降低,与发病年龄呈负相关;矽肺患者AM培养上清中细胞因子IL-1β、TNF-α、TGF-β1、IL-8、MCP-1及MIP-1a水平均高于观察对象,IL-1β、TNF-α、MCP-1的表达水平与脱尘年限呈负相关。揭示矽尘诱导的膜结合型死亡受体表达上调、可溶性死亡受体下调及细胞因子的差异表达在矽肺发生进展中起重要作用,死亡受体信号通路活化可能是矽肺发生发展的重要机制之一。
　　 2、矽尘暴露工人AM凋亡程度高于正常对照,AM凋亡程度随着矽肺期别的增高、三种死亡受体及Caspase-3表达水平的升高而增加,随着发病年龄的增大及脱尘年限的延长而降低。AM培养上清中细胞因子IL-1β、TNF-α、MCP-1水平随着AM凋亡程度的加重而升高,两者呈正相关。凋亡的变化规律与矽肺的发生规律相一致,说明AM过度凋亡可能是矽肺发生的细胞生物学机制之一,矽尘诱发的死亡受体信号转导异常是AM凋亡的主要原因,AM凋亡后释放炎性细胞因子增加可促进矽肺的发生发展。
　　 3、不同信号通路抑制剂在三条死亡受体信号通路的不同环节均可调节信号蛋白的表达水平、Ams的凋亡水平以及AM分泌的炎性细胞因子水平,说明三条死亡信号通路介导的Ams凋亡在矽肺发生发展中具有重要的调控作用。三条死亡受体信号通路均存在。NF-κB的活化,说明在矽肺发生发展过程中还存在抗凋亡机制;TNF-α/TNFR/NF-κB信号通路对Ams凋亡具有双向调控作用,在矽肺的发生发展过程中发挥双刃剑作用。