水通道蛋白在复合物48/80所致大鼠喉水肿中的作用研究

摘要

前言
　　 喉是呼吸道的门户,其声门下区是各种喉损伤因素,如感染、插管、过敏反应等最常累及的部位,由于其组织疏松易于水肿,而且外包环状软骨,使其空间相对固定,极易引起喉梗阻,如果不及时而正确的处理,会危及患者生命,因而,很多学者致力于喉水肿的研究,但迄今为止,其发生发展的内在分子机制尚未明确。近年研究发现了组织细胞中水通道蛋白(aquaporin,AQP)在控制水转运中起重要作用。
　　 AQP属于小分子(单体分子量约30kDa)、完整膜蛋白家族,主要表达于各类型细胞胞膜上,促进水顺渗透梯度的跨膜转运。研究表明AQP不但参与很多生理过程,而且与脑水肿、肺水肿、胃粘膜水肿、分泌性中耳炎等涉及水转运异常的病理过程有关。业已证明在喉部主要有AQP1、AQP3、AQP4、AQP5表达,它们可能参与喉生理、甚至病理过程。AQP是否与喉声门下区水肿的病理过程有关,目前尚未查到文献依据。
　　 研究还发现AQP的表达与肾脏、肺脏、皮肤等发育和功能成熟密切相关,喉水肿尤其多见于小儿,除小儿喉腔窄小、组织疏松等解剖因素外,是否与小儿和成人AQP表达的差异有关尚不清楚。
　　 目前,临床用于改善喉水肿的药物主要是地塞米松,研究表明它可以调节AQP的表达来改善脑水肿和肺水肿。高渗盐溶液(Hypertonicsaline,HS)作为一个渗透治疗制剂,可以在血管内外建立高渗梯度,促进水从血管周组织进入血液循环,因此被广泛用于脑水肿的治疗。HS改善脑水肿的作用与AQP的调节密切相关,但地塞米松改善炎性喉水肿的作用是否与AQP的调节有关,HS对喉水肿的作用及其机制的研究我们目前尚未查见文献报道。
　　 引起喉水肿最常见的原因是喉炎,研究表明喉部炎症水肿过程与广泛分布于粘膜上皮和粘膜下结缔组织中的肥大细胞的脱颗粒作用密切相关。Lidegran等证明肥大细胞脱颗粒剂复合物48/80可引起大鼠喉声门下区水肿,但参与的分子机制尚不明确。
　　 本实验的目的就是应用上述模型来探讨AQP在炎性喉水肿中的作用,从而为喉水肿的治疗提供新的方向。为此我们设计三个实验,首先,观察AQP1、AQP3、AQP4、AQP5在大鼠喉声门下区生后不同发育时期的表达及在成年大鼠喉声门下区的分布,为进一步AQP的功能研究打下基础;第二,观察AQP在复合物48/80所致大鼠喉水肿模型中的表达变化,以探讨AQP在喉水肿进展中的作用;最后,观察地塞米松和HS对上述喉水肿模型的作用及AQP的改变,探讨是否喉水肿的改善与AQP的调节有关。
　　 方法
　　 1、应用免疫印迹方法半定量检测生后1、7、14、21、56天的正常Sprague-Dawley(SD)大鼠喉声门下区AQP1、AQP3、AQP4、AQP5蛋白表达变化,应用免疫组化方法确定各AQP在成年大鼠喉声门下区的分布位置。
　　 2、选取成年健康雄性SD大鼠,随机分为4组,即对照组、水肿模型10min组、水肿模型30min组、水肿模型1h组。水肿模型组大鼠经尾静脉注射复合物48/80,对照组注射等量无菌水。分别测量新鲜喉声门下区组织(湿重,W)和烘干后的喉组织(干重,D)的重量,计算干湿重比值(W-D/W×100%)来确定喉水含量,行HE染色镜下观察喉水肿情况并评分,应用免疫组化和免疫印迹技术检测各AQP蛋白表达的变化。
　　 3、选取成年健康雄性SD大鼠,随机分为4组,即对照组、水肿模型组、地塞米松干预组、10%高渗盐溶液干预组。水肿模型制备同上,地塞米松干预组于注射复合物48/80后立即静脉注射地塞米松注射液(3mg/kg);高渗盐干预组于注射复合物后立即静脉滴注10%高渗盐溶液(10%HS,0.3ml/h)。同上法测量并计算喉水含量,HE染色观察并评分,检测AQP蛋白表达变化。
　　 结果
　　 1、免疫印迹结果显示AQP1、AQP3、AQP4、AQP5于生后大鼠喉声门下区均出现表达,随着生后时间的延长各AQP蛋白表达量均逐渐增加。免疫组化结果显示AQP1主要表达于大鼠喉声门下区血管内皮细胞,AQP3、AQP4主要表达于喉粘膜上皮细胞,AQP5主要表达于粘膜下腺体上皮细胞。
　　 2、水肿模型10min和30min组大鼠喉部水含量明显增加,与对照组比较有统计学意义(P＜0.05),之后逐渐减少,水肿模型lh组与对照组比较差异无统计学意义。HE染色可见水肿模型10min和30min组喉声门下区组织疏松水肿,大量炎性细胞浸润,损伤分数与对照组比较均有统计学差异(P＜0.05),水肿模型1h组组织水肿减轻,水肿评分与对照组比较差异无统计学意义,但仍有大量炎细胞浸润,炎细胞浸润评分与对照组比较有统计学差异(P＜0.05)。免疫组化和免疫印迹显示水肿模型10min和30min组AQP1和AQP5表达明显下降,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),而AQP3和AQP4的表达与对照组比较差异无统计学意义,水肿模型1h组AQP1表达升高,与对照组比较无统计学差异,AQP5的表达仍低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 3、高渗盐干预组喉部水含量显著小于水肿模型组(P＜0.05),地塞米松干预组喉水含量与水肿模型组比较无显著性差异,HE染色和损伤评分显示HS显著减轻了喉水肿,与模型组比较有统计学差异(P＜0.05),但没有明显减少炎细胞浸润;地塞米松没有明显减轻此模型的喉水肿,但显著减少了组织炎细胞浸润,与模型组比较有统计学差异(P＜0.05)。免疫组化和免疫印迹显示高渗盐干预组AQP1的表达与水肿模型组比较显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05),而AQP5的表达与水肿模型组比较无统计学差异;地塞米松干预组AQP5的表达与水肿模型组比较显著提高,差异有统计学意义(P＜0.05),而AQP1的表达与水肿模型组比较无统计学差异。
　　 结论
　　 1、AQP1、AQP3、AQP4和AQP5随着大鼠喉声门下区的生后发育表达逐渐增强,提示AQP与大鼠生后喉发育成熟有关;
　　 2、AQP1、AQP3、AQP4、AQP5的表达出现在大鼠喉声门下区不同的位置,说明它们可能在大鼠喉声门下区的生理和病理过程中起到不同的作用;
　　 3、AQP1与肥大细胞脱颗粒剂所致的大鼠喉声门下区炎性水肿的进展和改善、以及高渗盐减轻喉水肿作用密切相关;
　　 4、AQP5与肥大细胞脱颗粒剂所致的大鼠喉声门下区炎性反应和地塞米松的抗炎作用密切相关;
　　 5、AQP1和AQP5在炎性喉水肿进展过程中起重要作用,可能成为临床治疗炎性喉水肿的一个新的分子靶向。