小鼠血清糖蛋白质组富集及鉴定

摘要

前言：糖基化修饰是蛋白质翻译后一种比较常见和重要的翻译后修饰形式。糖基化修饰涉及到很多生理功能和生物学通路。蛋白质糖基化形式的改变和很多重要疾病如:癌症、炎症反应和神经退行性疾病密切相关。糖蛋白成为疾病诊断、预后和对于药物治疗反应的重要靶标。现在得到广泛研究是N-连接糖蛋白和O-连接糖蛋白。已经发现N-糖基化蛋白质与多种重要的生理过程密切相关(如转化生长因子-β1信号通路和表皮生长因子信号通路等),N-糖蛋白的还与多种疾病,特别是癌症相关(如肝癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等)。越来越多的研究表明,监测某些N-糖基化蛋白质的表达水平变化,较检测这些蛋白质的总体表达水平变化(如AFP),对疾病诊断具有更好的特异性和灵敏度。
　　 材料和方法
　　 一、实验对象:选用5只C57小鼠血清混合进行实验。
　　 二、方法:对于糖基化肽段的鉴定之前关注的很少,本课题我们关注了N-糖基化位点血清的分析。对于糖肽富集主要采用肼化学和凝集素的方法进行富集鉴定实验。肼化学方法是基于肼化学试剂与固相支持物相连接,通过糖苷酶F释放N-连接糖基化肽段。通过串联质谱鉴定目的肽段。我们应用此方法鉴定血清中分泌蛋白。
　　 结果：
　　 我们是用固相萃取N-连接糖肽,是用串联质谱鉴定N-连接糖基化位点。该方法氧化成醛,它可以固定在一个固相支持糖肽的碳水化合物上。随着肼化学结合串联质谱分析,在93个蛋白中鉴定到108个糖基化位点。
　　 在本课题中,我们把重点方法大规模鉴定糖肽的方法学。这种方法被称作滤膜辅助的样品制备。用三种凝集素CoA,WGA和RCA120联合富集。方法的原理是基于糖肽和亲和捕捉试剂的结合,在超滤管中进行蛋白的消化酶切。然后是由糖苷酶切去糖肽,是用串联质谱方法鉴定去糖基化肽段。本实验从小鼠血清中得到381个非冗余糖基化肽段和319糖蛋白。而且这些鉴定到的肽段全部严格含有N-X-[S/T]-X(其中X为非脯氨酸)序列,不含有N-X-C或无意序列。
　　 结论：
　　 本课题对于血清N-糖基化位点进行深入鉴定糖蛋白质方法是分别使用凝集素和肼化学方法富集串联质谱。我们鉴定了423个糖基化肽段和348个糖蛋白,建立了小鼠血清糖蛋白表达谱。我们的策略有以下几个优点:(1)高效的糖蛋白富集策略是鉴定血清中糖蛋白重要方法。(2)本研究建立的规模化精确鉴定N-糖蛋白质的策略对发现肿瘤标志物具有重要的应用价值,同时为糖蛋白质组的生物信息学研究提供了宝贵的基础数据集。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词

前言

实验材料

一、材料与主要试剂

二、主要仪器设备

三、血清制备

四、蛋白定量

五、实验方法

六、液相色谱分离和质谱鉴定

实验结果(附论文图片)

讨论

结论

本研究创新性自我评价

参考文献

附录:鉴定蛋白列表

综述:基于质谱的糖蛋白质组学研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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