氯化铵通过内源性哇巴因激活通路诱导星形胶质细胞钠,钾-ATP酶α2亚型表达上调

摘要

本研究分为二部分：
　　 第一部分、氯化铵通过内源性哇巴因激活通路诱导星形胶质细胞钠，钾-ATP酶α2亚型表达上调
　　 急性肝衰竭患者，脑氨浓度可以达到毫摩尔水平。成人大脑星形胶质细胞对肝衰竭更敏感。本实验室早期研究报道，慢性氨处理原代培养小鼠星形胶质细胞能增加Na，K-ATPase活性。Na，K-ATPase由α和β亚基组成。α亚基多次跨膜并含有Na+、K+、ATP和其特异性抑制剂哇巴因的结合位点。p亚基是单跨膜糖蛋白，其大部分位于膜外。α亚基有四种亚型，分别是α1、α2、α3和α4，而只有前三种在成熟脑中有表达。在培养的小鼠脑细胞中，α1亚型在神经元和星形胶质细胞均有表达，α2亚型仅在星形胶质细胞表达，α3亚型仅在神经元表达。α1亚型与畦巴因的亲和力较低(原代培养小鼠星形胶质细胞和神经元KD分别是9.3和1.5μM)，而α2亚型和α3亚型与哇巴因的亲和力较高(KD分别是80和110 nM)。高浓度哇巴因长时间处理原代培养的大鼠星形胶质细胞，α1亚型表达上调。因为培养的大鼠星形胶质细胞不表达α2亚型，所以上述结果并不能说明钠，钾-ATP酶α2亚型是否有变化。
　　 有研究报道高浓度氨处理星形胶质细胞，不但能增加Na，K-ATPase活性，同时还刺激哇巴因复合物的生成，所以氨诱导星形胶质细胞Na，K-ATPase活性增加可能因哇巴因复合物生成增加所致。此外研究发现心脏表达的Na, K-ATPaseα2亚型与哇巴因诱导心肌收缩力增强有关；从肾衰竭病人体内提取的一种哇巴因复合物与大鼠的三种α亚型均有较高的亲和力。然而关于Na，K-ATPase和哇巴因复合物的亲和力机制还有待阐明，并不能确定氨作用于大脑后能上调哪种亚型。
　　 哇巴因不仅是Na，K-ATPase特异性抑制剂，还可以增加Na，K-ATPase的活性。这一理论看似矛盾，但哇巴因除了抑制效应，在低浓度(0.1-1 nM)时，通过信号传导通路可激活肾脏（表达α1亚型）表达的Na，K-ATPase。信号通路包括非受体酪氨酸激酶Src激活，Src介导表皮生长因子受体和酪氨酸磷酸化。在心肌细胞（表达α1和α2亚型）系，畦巴因通过相同的信号通路介导ERK1/2磷酸化。
　　 我们研究的目的是：①在mRNA和蛋白水平，氯化铵对原代培养星形胶质细胞α1和α2亚型及小脑颗粒神经元α1和α3亚型的影响，以确定受调控的亚型；②腹腔注射尿素酶建立小鼠高血氨模型，高血氨对脑内表达的α1、α2和α3亚型的影响，以明确受调控的亚型是否与体外相似；⑨上皮生长因子受体(EGFR)抑制剂AG1478，酪氨酸激酶Src抑制剂PP1，Zn2+_依赖性金属蛋白酶抑制剂GM6001对氨-诱导调控α亚型的影响，以阐明信号通路；④在mRNA水平，哇巴因对原代培养星形胶质细胞的α1和α2亚型及小脑颗粒神经元α1和α3亚型的影响，以明确受调控的亚型是否与氯化铵相似；⑤AG1478和GM6001对哇巴因-诱导调控α亚型的影响，以阐明哇巴因是否参与氨，诱导调控α亚型的信号通路。
　　 方法：采用原代培养小鼠星形胶质细胞和小脑颗粒神经元。①分别用不同浓度氯化铵(0.3、1、3和5 mM)处理星形胶质细胞1-5天及小脑颗粒神经元1-2天，用RT-PCR和免疫印迹方法检测药物对Na，K-ATPaseα1、α2和α3三种亚型的作用；②小鼠腹腔注射尿素酶1-5天建立高血氨模型后，用RT-PCR和免疫印迹方法检测药物对Na，K-ATPaseα1、α2和α3三种亚型的作用；③3 mM氯化铵处理正常细胞3天后，观察Na，K-ATPaseα1和α2二种亚型mRNA或蛋白表达水平，并且检测这一作用是否可被AG1478、PP1和GM6001所抑制；④10 ng/ml EGF处理星形胶质细胞1-3天，用RT-PCR和免疫印迹方法检测药物对Na，K-ATPaseα1和α2两种亚型的作用；⑤分别用不同浓度哇巴因(0.001-100μM)处理星形胶质细胞3天及小脑颗粒神经元2天，用RT-PCR方法检测药物对Na，K-ATPaseα1、α2和α3三种亚型的作用，并且检测这一作用是否可被AG1478和GM6001所抑制；使用SPSS12.0软件进行统计学分析，多组资料用one-way ANOVA方法进行比较，P<0.05表示差异具有统计学意义。
　　 结论：①浓度为3和5 mM氯化铵作用星形胶质细胞1-4天，Na，K-ATPaseα2亚型表达上调，而α1亚型表达没有改变；②建立小鼠高血氨模型，亚型表达情况与体外培养一致；③根据研究结果及相关文献我们推测：氯化铵引起内源性哇巴因生成增加，哇巴因与Na，K-ATPase结合激活Src，活化的Src激活EGR受体，后者激活Ras/RaflMEK通路，引起ERK1/2磷酸化，最后上调α2亚型的基因表达。
　　 第二部分、Fluxotine对小鼠星形胶质细胞节律基因Per1、c-fos、fosB及5-HT2B受体表达的影响生物体机能活动的昼夜节律是一种基本的生命现象，由一系列细胞-自发性生物钟控制。目前认为哺乳动物下丘脑的视交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)是昼夜节律的一个主要起搏器。它和外周组织的生物钟共同控制机体的24小时行为和生理节律。SCN接受外界环境光照信号及某些化学物质（如褪黑素和5．羟色胺等）的诱导，在大脑和外周组织产生节律性振荡。许多细胞，包括原代培养的星形胶质细胞具有内源性钟基因，受外界刺激（例如换液）可以自发产生持续的节律反应，这种节律反应通常能持续3个周期。
　　 在分子水平，SCN和外周组织的生物钟组件相似，都是由转录，翻译反馈环路组成。负反馈环路包括两个转录启动子，即CLOCK和BMAL1。CLOCK和BMAL1二聚体形成促发Period(per1、per2和per3)和Cryptochrome(Crv1和Cry2)基因的转录。在负反馈环路中，PER:CRY二聚体移位到细胞核内，与CLOCK:BMAL1复合物结合，抑制自身转录。除了钟基因，还有大量钟控基因，这些钟控基因也具有生物节律性，例如即刻早期基因c-fos和fosB。
　　 星形胶质细胞表达大量神经递质受体，在维持大脑正常功能中发挥重要作用。有研究表明阻断细胞间的缝隙连接或抑制胶质细胞新陈代谢可以破坏大脑SCN区域和正常动物的昼夜节律，所以星形胶质细胞在维持正常昼夜节律中可能也发挥重要作用。星形胶质细胞功能障碍是重度抑郁症患者(Major depressive disorder,MDD)的主要病理特征。一般认为昼夜节律的改变是导致患者心境障碍重要因素。对整体动物和体外SCN区域脑切片的大量研究表明，光照和其它因素（急慢性氟西汀处理）可以影响SCN区的生物钟。氟西汀是选择性5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂(SSRI)。我们先前研究报道氟西汀选择性激活星形胶质细胞上5-HT2B受体(5-HT2BR)，急性氟西汀导致细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)升高，EGF受体活化，活化的EGF诱导ERK磷酸化及c-Fos和FosB表达上调；慢性氟西汀使CPLA2表达上调和GluK2编辑。5-HT是一种重要的神经递质，其受体有7种。5-HT2受体分为5-HT2A、5-HT2B和5-HT2C三种亚型。三种5-HT2受体均为Gq/11蛋白偶联受体，它们能活化磷脂酶C(PLC)，后者可分解磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)产生二脂酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)，此反应导致细胞内游离钙离子浓度增加。在原代培养的星形胶质细胞上三种亚型均有表达，但主要表达5-HT2BR，dBcAMP能影响5-HT2BR的表达。但原代培养的星形胶质细胞不表达5-羟色胺运载体。因为临床上应用SSRls，通常在2-3周后起作用，所以我们对氟西汀的慢性作用更感兴趣。本课题研究的目的是在原代培养的星形胶质细胞和整体动物中观察氟西汀对节律基因Per1、c-fos、fosB及5-HT2BR的影响。
　　 方法：
　　 采用原代培养的小鼠星形胶质细胞。①原代培养小鼠星形胶质细胞两周后，细胞长满培养皿，用含10％马血清（对照组），和10μM氟西汀，换液后，收集不同时间的细胞用RT-PCR检测Per1、c-fos、fosB及5-HT2BR mRNA表达；②原代培养小鼠星形胶质细胞两周后，细胞长满培养皿，用含10％马血清（对照组），含有0.25 mM dBcAMP，10μM氟西汀和0.25 mM dBcAMP加10μM氟西汀，换液，三天后收集不同时间的细胞。用RT-PCR检测Per1、c-fos、fosB及5-HT2BRmRNA表达。
　　 饲养正常小鼠，光暗周期控制为12∶12，小鼠被饲养4周。腹腔分别注射PBS（对照组）和氟西汀(10 mg/kg)一周。7天后取不同时间点的小鼠大脑。
　　 使用SPSS12.0软件进行统计学分析，多组资料用one-way ANOVA方法进行比较，P<0.05表示差异具有统计学意义。
　　 结论：
　　 在原代培养星形胶质细胞和整体动物中，Per1、c-fos、fosB和5-HT2BR的表达具有节律性。dBcAMP能使Per1、c-fos、fosB和5-HT2BR表达幅度增加，但不影响周期性和衰减率。氟西汀能增加Per1、c-fos、fosB和5-HT2BR的表达幅度，慢性氟西汀处理细胞能改变c-fos和fosB的周期性，急性氟西汀处理使Per1、c-fos、fosB和5-HT2BR的表达衰减加速。