HIV-1跨膜蛋白gp41在大肠杆菌中的表达及纯化

摘要

1985年，法国巴斯德实验室从患者体内第一次分离出1种新的逆转录病毒，随后将其命名人免疫缺陷病毒( Human Immunodeficiency Virus，HIV)，该病毒感染所致的体内CD4+T细胞显著下降、发生机会感染及恶性疾病为特征的继发性免疫缺陷综合征，称之为免疫缺陷综合征(Acquired Immuno deficiency Syndrome，AIDS)。据卫生部统计，中国自1985年出现第一例艾滋病病人以来，截至2010年11月底，累计报告艾滋病病毒感染者和病人37万余例。HIV是一种潜伏期极长的逆转录病毒。根据血清学反应和病毒核酸序列测定，将HIV分为两型：HIV-1型与HIV-2型。除少数源于西非的毒株外，几乎所有病例感染的都是HIV-1。在HIV-1型内，根据包膜蛋白env基因和壳蛋白的gag基因序列，进一步将其分为三个基因亚型（组）以及14个流行重组型，包括CRF01_AE、CRF02_AG、CRF03_AB、CRF05_DF等[2]。而在我国东北地区，最常见为CRF01_AE亚型[3]。本文实验所用的HIV-1型CRF_01AE亚型gp41-cDNA目的基因均来自中国医科大学附属第一医院艾滋病研究所。
　　 当今，实验室检测是诊断HIV感染的主要手段。常用的是ELISA法、免疫印迹法(WB)、p24抗原检测及HIV抗体非传统的检测法。而这些检测方法的基本核心原料则是HIV-1gp41抗原蛋白，因此，拥有优质的HIV-1gp41抗原，对于HIV快速检测品的研制起着举足轻重的地位。研究表明，艾滋病病人的血液、尿液和唾液中都存在着HIV抗体，通过抗原-抗体的特异结合反应，达到检测品的检测原理。另外，据最新报道，感染HIV病毒的各期病人尿液中均含有抗艾滋病病毒的抗体。因此，用尿液代替血液检测HIV抗体，为HIV诊断试剂的发展提供了新方向。采用尿液检测的优势有：一、由于HIV感染者的尿液中仅含有HIV抗体，而不是有着传染性的病毒本身，因此HIV不通过尿传播，可以安全地收集和运输尿样到实验室；二、采样简便，可在任意时刻采取尿样检测，便于大规模筛查，无需针头取血，减少医患之间传播的危险；三、尿液无需浓缩和预处理，抗HIV-1抗体可在尿液中长期存在（2℃-8℃可保持一年；在15℃-0℃可保持55天）。四、快速，全部检测过程仅需10-15分钟；五、肉眼判定结果，随时随地进行价格低廉：不需要特殊培训和特殊仪器。另外，在研制尿液HIV快速诊断试纸条的过程中，所需的HIV-1gp41抗原购自于SANTA公司（美国）和一些国内公司，结果发现：国外HIV-1gp41抗原蛋白优质但价格昂贵，而国内生产的则效果不好且价格不菲，于是便产生了本实验的构想，自己亲自表达出HIV-1gp41抗原蛋白，不仅保证了充裕的原材料，而且也节省了开资，为研制高灵敏度HIV检测试纸条提供依据。
　　 目的：
　　 从获得的HIV-1型CRF_01AE亚型gp41-cDNA目的基因后，通过对HIV全基因组基因序列的比对，选择HIV-1型外膜蛋白env-gp41中保守区(5796-8369)中的部分基因片（7311-8366，共计1055bp）进行基因扩增；并将其与T载体连接后，克隆入表达载体pET28a内，构建重组载体pET28a-gp41-T载体，在E.colib121TM中表达该蛋白并摸索其表达量的最适条件，最终纯化出优质抗原蛋白。
　　 方法：
　　 对HIV-1的外膜蛋白env进行修饰，并利用巢式PCR技术克隆env-gp41基因，同时引入BamHI和XhoI酶切位点，并与T载体相连接，构建出gp41-T载体，同时对pET28a进行双酶切，低熔点琼脂糖电泳回收gp41-T载体、pET28a片段后，采用T4DNA连接酶将两片段连接。酶切鉴定及测序鉴定后，将正确重组的质粒pET28a-gp41-T载体转化感受态E.colibl21TM(DE3)，IPTG诱导表达，应用SDS-PAGE、Westernblot、ELISA检测法对其表达情况进行验证，表明目的基因表达成功。然后对其进行大量诱导表达，并进行蛋白纯化及除盐，对最终纯化出的蛋白进行浓度测定和验证，为进一步获得优质的HIV-1gp41抗原奠定了基础。
　　 结果：
　　 成功构建出pET28a-gp41表达质粒，并经多种实验验证及测序鉴定，最终结果表明，构建后的env-gp41基因能在16℃诱导的条件下表达，对表达的env-gp41蛋白进行纯化、除盐，最终得出较好的免疫原性的env-gp41蛋白。
　　 结论：
　　 正确重组克隆的pET28a-gp41，37℃时在大肠杆菌BL21(star)中未见其表达，而在16℃条件下诱导，可见其表达，主要原因可能是env蛋白对原核系统产生毒性所致，而低温可以有效降低这种细胞膜的毒性作用，减少宿主菌的死亡，从而成功表达。在pET28a-gp41转化到表达菌BL21(star)后，发现大肠杆菌生长变得非常缓慢，与空载体转化后的菌相比需要更长的时间才能达到诱导所需的光密度值。另外，在gp41的mRNA二级结构中发现有茎一环结构，对表达可能有一定的影响，gp41蛋白的穿膜作用可能是影响env基因在大肠杆菌中表达的主要因素。得到的蛋白通过亲和层析柱对其目的蛋白进行纯化，ELISA检测，而得到优质抗原，最终为下一步研究HIV尿液检测试纸条及疫苗的研制奠定了基础。

目录

文摘

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英文缩略语

论文 HIV-1跨膜蛋白gp41在大肠杆菌中的表达及纯化

前言

材料与方法

实验结果

讨论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 HIV-1跨膜蛋白gp41在原核大肠杆菌和真核毕赤酵母菌中表达体系的构建和比较

参考文献

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