恒定磁场对大鼠骨髓基质干细胞成骨的影响及作用MG63细胞验证无镍不锈钢生物相容性的研究

摘要

目的：实验第一部分:首先利用稀土磁铁钕铁硼在实验室条件下构建一个恒定磁场,采用全骨髓培养法分离培养大鼠的骨髓来源基质干细胞,经过表面标志检测后,传代扩增,将一部分基质干细胞接种于直径3.5cm培养皿中,然后将接种了基质干细胞的培养皿分为两组,第一组采用药物来诱导基质干细胞成骨的方法,即使用成骨条件培养基(含10％胎牛血清的DMEM培养基中加入0.1uM的地塞米松,10Mmβ-磷酸甘油钠,0.2mM的维生素C)。将大鼠的骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导。另外一组首先加入与第一组相同的药物诱导成骨培养基,之后将培养皿放在细胞培养箱的稀土磁铁钕铁硼上,每天放置12小时使其在恒定磁场下暴磁,之后将其放入另外的细胞培养箱中培养。两组细胞分别连续培养7天,在1、3、5、7天分别取出两组细胞进行细胞形态光镜观察,用MTr法进行细胞增值检测,碱性磷酸酶表达水平检测,细胞VonKossa染色,第七天进行细胞爬片的扫描电镜观察。比较两组细胞成骨能力的不同,进而评价恒定磁场在大鼠基质干细胞体外成骨诱导中的作用。同时,将另外一部分基质干细胞接种与金属钛表面,将接种了基质干细胞的钛片放入直径3.5cm的培养皿中,同样分为两组,一组加入药物诱导成骨培养基,另外一组在加入药物诱导成骨培养基的同时按照同样方法进行周期性的磁场刺激。在接种基质干细胞24h后,检测两组钛片表面的细胞粘附率,在连续培养7天后,对两组钛片表面进行碱性磷酸酶染色和扫描电镜观察,比较两组细胞成骨趋势的不同,进而评价恒定磁场对于钛表面生长的基质干细胞的成骨作用的影响。实验的第二部分是使用MG63细胞系来检测新型生物材料无镍不锈钢的生物相容性。首先培养扩增MG63细胞,之后将MG63细胞分别接种于无镍不锈钢,317L,CoCrMo合金的表面,置于6孔板中,培养基为含10％胎牛血清的DMEM培养基,在开始培养12小时后检测三种金属表面的细胞粘附率,在培养的1,3,5天进行MTT检测,碱性磷酸酶检测,金相显微镜观察,比较三中金属生物相容性的不同。
　　 方法：实验一所需要的恒定磁场由稀土磁铁钕铁硼产生,首先与中国科学院金属研究所合作测定实验所用的稀土磁铁钕铁硼的磁场强度,将稀土磁铁钕铁硼用75％的乙醇浸泡20min.风干后于紫外线照射30min.保持无菌状态移入细胞培养箱,过夜后备用。由中国医科大学实验动物中心提供的四周龄SD大鼠(雌雄不限),脱颈处死后浸泡于75％的酒精中30min。无菌取出大鼠的双侧股骨,尽量去除软组织,用无菌剪刀剪除两端,用含10％胎牛血清的DMEM冲洗骨髓腔,所得的液体经过200目筛网,收集液体接种于25cm2培养瓶中,放入细胞培养箱中,5％CO2、37℃,24小时后换液,首次换液禁用PBS缓冲液洗涤细胞,轻轻倒出原培养基,小心注入新鲜培养基。倒置显微镜观察,当细胞接近与75％相互接触时,进行细胞传代。一般4-5天传代,传代比例为1:3,取前两代细胞进行细胞表面抗原检测,对基质干细胞进行鉴定。当细胞扩增到所需数量时,即可着手准备对细胞进行诱导和相关检测了。首先将培养瓶中的培养基倒掉,PBS缓冲液洗涤细胞,加入2.5％的胰蛋白酶5ml消化5min(此过程在光镜监视下完成),轻轻倒掉胰蛋白酶,加入2ml培养基反复吹打,收集液体于离心管中,1000r/min离心5min.弃去上清,2ml培养基重悬细胞,细胞计数板细胞计数,调整细胞密度为4×104/ml,接种于3.5cm培养皿2ml。1天后换液,3天后再次换液,5天后光镜下检查培养皿,选择细胞生长均匀,形态良好,无大片空白区或重叠生长的培养皿为本实验选材。将经过筛选的培养皿随机分为两组,,第一组采用药物的基质干细胞诱导成骨方法,即在含10％胎牛血清的DMEM培养基中加入0.1uM的地塞米松,10mMβ-磷酸甘油钠,0.2mM的维生素C.将大鼠的基质干细胞向成骨细胞方向诱导。另外一组首先加入与第一组相同的药物诱导成骨培养基,之后将培养皿放在细胞培养箱的稀土磁铁钕铁硼上,每天放置12小时,之后将其放入另外的细胞培养箱中培养。两组细胞分别培养7天,在1、3、5、7天分别取出两组细胞进行细胞形态光镜观察并且照相,在相同的时间点上,将两组细胞浓度调整为1×104/ml,并接种在96孔板中,每孔加20ul的MTT,置于37℃培养箱中孵育4小时取出,吸除培养基后每孔加150ul的二甲基亚砜10分钟后充分震荡,置酶标仪上选择490nm波长测0D值。每次实验重复五次。同样在相同时间点上,从两组中取出培养皿,用PBS轻轻冲洗3遍,在4℃环境下用0.01％TritonX-100裂解细胞12h,然后用吸管反复吹打1min,使细胞充分碎解。以14000r/min离心5min,吸取一部分上清液并用对一硝基苯磷酸盐(即PNPP)法检测ALP(试剂盒),另一部分上清液用考马斯亮兰法测定总蛋白含量。碱性磷酸酶活性以每克蛋白中含有的金氏单位表示,结果以五次独立实验的平均值表示。对于VonKossa染色,将在测试时间点上的培养皿用含10％甲醛的PBS固定10min.之后用水清洗干净,加入2％的硝酸银溶液,在紫外线下孵育1h,之后用3％的硫代硫酸钠中和5min,倒置显微镜下观察照相。成骨能力旺盛的细胞会被银原子染成黑色。在诱导的第7天,取出两组中的盖玻片进行扫描电镜观察。具体方法为:事先将无菌的盖玻片放入培养皿中,将1.5ml的密度为1×104/ml的基质干细胞滴在盖玻片上,依靠表面张力使液体不外流。按照实验条件分为两组。连续诱导7天,在第7天时取出盖玻片,置于2.5VOL％戊二醛固定液于4℃度冰箱中固定(最短两小时)。吸去戊二醛固定液,加入蒸馏水清洗,随后分别用50、75、95、100vol％的乙醇水溶液进行系列脱水各十分钟。将样品取出后放入玻璃培养皿中。4℃冰箱中干燥12小时或过夜干燥。采用扫描电子显微镜(SEM)对基质干细胞的形态等进行观察和分析并比较。另外取大鼠骨髓基质干细胞,接种于直径为1cm的金属钛片上,将钛片置于直径为3.5cm的细胞培养皿中,将接种了基质干细胞的钛片随机分为两组,一组加入药物诱导培养基,另外一组除加入药物培养基外,同时按照以上的方法进行磁场周期性刺激,两组细胞连续培养7天,在最初的24小时后,分别取两组钛片进行细胞粘附率检测,7天后分别对两组细胞进行碱性磷酸酶染色和扫描电镜观察,碱性磷酸酶染色采用试剂盒法,随机选取5个视野,计算染色细胞占总细胞的比例,计算比较。,扫描电镜采用以上方法进行样本制备。比较两组细胞形态的不同。实验的第二部分:关于无镍不锈钢的生物相容性的研究,采取以下方法:首先制备三种金属的金属片样本,金属片直径为1cm厚度为1mm的圆形,超声清洁消毒后备用,首先进行MC63细胞的传代扩增。待细胞达到所需数量后,将细胞以4×104/ml接种与金属片上,每个金属片1ml,利用表面张力使液体不外流,在培养的第12小时,分别取出3组金属片,用PBS轻轻冲洗表面,去除未贴壁细胞,加入0.25％的胰蛋白酶将贴壁细胞消化下来,收集后细胞计数,计算12小时的细胞贴壁率,并且相互比较。在培养的1,3,5,天,分别取三组金属片的细胞按照实验1的方法进行MTT,碱性磷酸酶检测,并在金相纤维镜下观察细胞生长状态。以上实验数据分析采用SPSS数据分析软件,配对t检验,p＜0.05有统计学差异。
　　 结果：实验一的结果为,在1天时,两组间的MTT检测,ALP活性检测,VonKossa染色,无明显区别,在第3天时,ALP活性检测,VonKossa染色依然没有统计学差异。而MTT检测显示细胞增值有统计学差异。在5、7天时,所有检测均有统计学差异。扫描电镜在第7天显示两组细胞形态有明显差异。在金属钛表面实验部分结果为在接种基质干细胞24h后,两组钛表面的细胞粘附率有统计学差异,磁场组的粘附率要高于非磁场组。在第七天时,碱性磷酸酶染色结果显示磁场组的阳性率要高于非磁场组,差异有统计学意义。扫描电镜可见磁场显著改变了基质干细胞的表面形态,细胞被拉长。实验二部分的结果为在12小时,三组细胞的贴壁率无统计学差异。关于碱性磷酸酶检测,在第一天时,三种金属无统计学差异,在第三天和第五天时,无镍不锈钢的碱性磷酸酶的活性要高于另外两种金属。细胞的MTT检测显示在第一天时,三种金属无统计学差异,在第三天和第五天时,无镍不锈钢的细胞增值要高于另外两种金属。
　　 结论：0.2T的恒定磁场可以显著增强骨髓基质干细胞在体外和金属钛表面向成骨细胞的分化增值能力,并可以使细胞的形态发生改变。无镍不锈钢的生物相容性要好于317L和CoCrMo合金。