番茄煤霉病生防融合子的鉴定及拮抗性研究

摘要

实验室以对番茄病原真菌有较好拮抗作用的链霉菌菌株A和哈茨木霉T-23两株远缘菌株为出发菌株，通过原生质体融合技术得到了融合菌株F1、F2、F3、F4、F5、F6。本文通过形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记分别对融合菌株进行鉴定，对融合子的拮抗机制进行了初步的研究，并进行了盆栽试验。结果如下： 通过形态学及孢子大小、体积的分析，可初步认为融合子F2、F4为重组单倍体。对可溶性蛋白凝胶、酯酶同工酶、过氧化氢同工酶、过氧化物同工酶及超氧化物歧化酶同工酶电泳谱带进行分析，结果显示融合菌株F2、F4具有与亲本菌株相同的谱带，亦有明显的特有谱带，证明在融合过程中发生了染色体片断的交换或基因重组，产生了新组分蛋白。然而，融合子酶蛋白在遗传继承上并不平均，F2与亲本哈茨木霉T-23相似性更高，F4则更接近于亲本链霉菌菌株A。RAPD分析显示融合子中F2与链霉菌L-A的相似指数最高，为50.0％。将融合子与两亲本的相似系数作比较，可以看出融合子与链霉菌L-A更为接近。说明在原生质体融合中，融合子从双亲获得的遗传信息不等，即较多的遗传物质来源于亲本链霉菌L-A。以上标记证明了融合子的真实性。 采用SDS-CTAB法、改进CTAB法和氯化苄法对真菌基因组DNA提取方法进行研究和改进，找到一种快速、高效的融合子基因组DNA提取方法，得到适合于分子生物学研究的高质量DNA，即SDS-CTAB法，所提取DNA条带完整，清晰明亮，浓度约为40μg/mL。 分别测定F2、F4的生长曲线，确定其对数生长期。分别用平板对峙试验和发酵滤液抑茵试验两种方法验证融合子F2、F4对番茄煤霉病菌的抑制效果均好于两亲本。在发酵滤液抑菌试验中，F2发酵滤液没有明显的抑菌现象，说明融合子F2可能不是以产抗生素作用为主，而是竞争与重寄生作用。因此，通过扫描电镜观察了融合子与病原真菌菌丝间的相互作用。测定四种拮抗菌的发酵滤液对番茄煤霉病菌的产孢量及萌发率的影响，融合子F4发滤液的抑制率最高为77.06％。 测定了发酵原液对番茄种子萌发的影响并进行了盆栽试验。发酵原液对番茄种子有一定的促生作用。盆栽试验结果表明，融合菌株的发酵液对番茄煤霉病有显著的预防和治疗效果，F4的预防和治疗效果分别达到52.52％和60.38％。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章DNA提取方法的研究及RAPD分子标记鉴定

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1基因组DNA的纯度检测结果

2.2基因组DNA的浓度检测结果

2.3 DNA浓度的调整结果

2.4 RAPD结果分析

3小结

第二章融合子的形态学和细胞学鉴定

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1菌落及发酵液形态的比较

2.2分生孢子体积的测量

2.3分生孢子DNA含量测定

3小结

第三章融合子的同工酶蛋白水平鉴定

1材料与方法

1.1供试菌种

1.2培养基

1.3主要试剂

1.4主要仪器

1.5实验方法

1.6干胶板的制作

2结果分析

2.1发酵条件对培养结果的影响

2.2同工酶电泳分析

3小结

第四章融合子对病原真菌产孢量及孢子萌发率的影响

1材料

1.1培养基

1.2供试菌株

2方法

2.1融合子F2的生长曲线的测定

2.2融合子F4的生长曲线的测定

2.3亲本及融合子的番茄煤霉病菌抑菌试验

2.4木霉菌T-23、链霉菌L-A及其融合子F2、F4的发酵滤液对番茄煤霉产孢量的影响

2.5木霉菌T-23、链霉菌L-A及其融合子F2、F4的发酵滤液对番茄煤霉孢子萌发的影响

3结果与分析

3.1融合子F2生长曲线的测定

3.2融合子F4生长曲线的测定

3.3木霉菌T-23、链霉菌L-A及其融合子F2、F4对番茄煤霉的抑菌试验

4 小结

第五章菌株发酵原液对番茄种子萌发的影响及盆栽试验

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1拮抗菌对番茄种子促生效果的测定

2.2盆栽试验

3小结

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表文章