虫草素抑制内质网应激引起的肾小管上皮细胞凋亡及机制探讨

摘要

内质网(endoplasmicreticulum,ER)是细胞中组装蛋白质的重要细胞器,具有合成胆固醇、脂质、激素等的功能。遗传信息通过核糖体翻译后形成一级结构的蛋白质,在内质网中进行折叠,形成特殊的空间构象,从而形成具有成熟功能的蛋白质。内质网中内环境的稳定是其发挥功能的基础。未折叠或错误折叠的蛋白质不能通过内质网分泌,并在内质网中聚积,引起内质网应激(ERstress,ERS),并引发未折叠蛋白反应(unfoldedproteinresponse,UPR)。很多病理生理过程,如缺氧、氧化应激、营养缺乏、细胞内钙紊乱等都可以引起内质网应激。当ERS超过UPR的清除能力,细胞便走向凋亡。目前的研究报道,神经系统疾病、糖尿病、代谢性疾病、病毒感染、药物引起的组织损伤及缺血缺氧等都和ERS有着密切的关系。肾脏很容易受缺氧缺血,炎症因子及药物等的毒性作用,引发各种类型的肾脏疾病。在肾脏病的发展过程中,高血压、高血糖、高血脂、蛋白尿、同型半胱氨酸血症等并发症也是ERS的诱导因素,持续存在的ERS将引导细胞走向凋亡。
　　 自噬是真核细胞中重要的病理生理过程,在正常状态下,自噬维持在一个很低的水平。在饥饿、应激、生长因子缺乏等情况下可激发细胞自噬。细胞内游离的双层细胞膜结构包裹细胞内的物质形成自噬体,然后和溶酶体融合,并使其中的物质降解,提供能量。有许多研究表明ERS可以引发细胞自噬,其机制并不明确,细胞内蓄积的蛋白质主要通过特异性泛素酶系统和非特异性细胞自噬来降解,ERS引发自噬可能是由于蛋白质蓄积本身引发的细胞自身调节机制,也可能由于ERS时,UPR通过一些分子通路激活自噬的过程。目前,ERS引起自噬的意义也存在争议,有报道称自噬可清除细胞内蓄积的蛋白质,促进细胞存活,也有报道发现过度的自噬可以引起细胞程序性死亡,在ERS诱导下加用自噬抑制剂可以减少细胞的凋亡,这也许和细胞种类以及ERS的程度,时间有关。mTOR是调节自噬始动阶段的重要分子,其上游的AMPK、Akt等分子通路是否都和自噬的发生相关,其中是否有ERS可以激活的通路仍不明确。
　　 虫草素(Cordycepin/3'-deoxyadenosin,3-DA.)自1975年由GaryM在《Nature》上首次报到后,其研究一直没有成为热点,且一直局限在抑制基因转录的和抑制肿瘤细胞生长等方面。在我国,冬虫夏草是十分名贵的中草药,很多中成药含有冬虫夏草的提取物,临床应用也有较好的疗效。肾脏病的治疗中也用到了这种中成药作为辅助治疗,如百令胶囊、心肝宝等,在减轻蛋白尿、调节机体免疫力方.面有一定的疗效,但其机制却不明确。
　　 近年来,我们研究发现,虫草素可以阻断UPR中促凋亡通路:IRE-JNK通路,增强促存活通路:PERK-eIF2α通路,抑制ERS引起的细胞凋亡。还有研究发现mTORC1可以增强IRE-JNK通路促进ERS引起的凋亡。此外,虫草素的其他生物学功能还有待进一步研究。
　　 本研究为明确内质网应激对肾小管上皮细胞的影响,以及虫草素的作用设计了以下实验:1、利用内质网应激诱导剂培养大鼠肾小管上皮细胞,诱导内质网应激,并观察细胞的凋亡情况。探讨内质网应激在肾小管上皮细胞中的作用;2、在大鼠肾小管上皮细胞中,诱导内质网应激,观察细胞内自噬的情况。探讨内质网应激对自噬的影响。利用自噬抑制剂阻断自噬,探讨自噬在内质网应激诱导凋亡中的作用;3、在内质网应激条件下,利用虫草素培养大鼠肾小管上皮细胞,观察细胞凋亡、自噬以及蛋白质S6K、AMPK和Akt的磷酸化情况。探讨虫草素在抑制细胞自噬、凋亡中的作用,以及可能的分子通路。
　　 一、内质网应激诱导肾小管上皮细胞凋亡
　　 目的:利用内质网应激诱导剂培养大鼠肾小管上皮细胞,诱导内质网应激,并观察细胞的凋亡情况。探讨内质网应激在肾小管上皮细胞中的作用。方法:1、大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)内质网应激的确定。用不同浓度Tunicamycin(Tm)和Thapsigargin(Tg)刺激NRK52E细胞,或用Tm和Tg在不同时点刺激NRK52E细胞。培养结束后,用NorthernBlot法测定GRP78和CHOPmRNA的表达,用荧光酶素法测定ERSE和UPRE的活性。2、用选定的内质网诱导剂Tm2.5μg/ml培养NRK52E细胞,观察细胞的凋亡。WST法测定存活细胞比率。WesternBlot法观察caspase-3蛋白的表达。结果:1、Tin和Tg诱导GRP78和CHOPmRNA的表达上调,ERSE和LYPRE的活性上调,且呈剂量和时间依赖性。2、Tm培养细胞48小时后,出现明显凋亡。存活细胞比率明显下降。Caspase-3蛋白表达升高。小结:1、Tm和Tg可以诱导大鼠肾小管上皮细胞发生内质网应激。2、由Tm2.5μg/ml诱导的内质网应激可以引起大鼠肾小管上皮细胞凋亡。
　　 二、自噬在内质网应激诱导肾小管上皮细胞凋亡中的作用
　　 目的:在大鼠肾小管上皮细胞中,诱导内质网应激,观察细胞内自噬的情况。探讨内质网应激对自噬的影响。利用自噬抑制剂阻断自噬,探讨自噬在内质网应激诱导凋亡中的作用。方法:1、用Tm2.5μg/mL培养NRK/RFP-LC3或NRK52E细胞,观察不同时点细胞自噬体形成的情况。用WesternBlot法观察LC3蛋白的表达。2、将NRK/RFP-LC3或NRK52E细胞分为对照组、内质网应激组、内质网应激+自噬抑制剂组和自噬抑制剂组,分别加入相应试剂培养,观察不同时点自噬体形成情况。以及细胞凋亡情况。结果:1、6小时后NRK/RFP-LC3细胞中RFP标记的:LC3聚集,形成颗粒状的自噬体,6小时后,NRK52E细胞中LC3-Ⅱ的表达增加。表示自噬的活化。2、Tm2.5μg/ml和自噬抑制剂wortmannin50nM共同培养细胞6小时,RFP的表达仍均匀分布于胞浆中,无明显自噬体形成。Tm2.5μg/ml和自噬抑制剂wortmannin50nM共同培养的NRK52E细胞凋亡明显减少,贴壁细胞形态大部分正常。小结:1、内质网应激可以活化大鼠肾小管上皮细胞中的自噬作用。2、过度活化的自噬作用参与内质网应激诱导的细胞凋亡。阻断自噬的过度活化可以抑制内质网应激引起的细胞凋亡。
　　 三、虫草素抑制内质网应激诱导的肾小管上皮细胞凋亡及机制探讨
　　 目的:在内质网应激条件下,利用虫草素培养大鼠肾小管上皮细胞,观察细胞凋亡、自噬以及蛋白质S6K、AMPK和Akt的磷酸化情况。探讨虫草素在抑制细胞自噬、凋亡中的作用,以及可能的分子通路。方法:1、将NRK52E细胞分为对照组,内质网应激组,内质网应激组+虫草素组和虫草素组,并用相应试剂培养。观察细胞的凋亡情况。2、将NRK/RFP-LC3细胞或NRK52E细胞分为对照组,内质网应激组,内质网应激组+虫草素组和虫草素组,并用相应试剂培养6小时,观察自噬体的形成情况。用WestemBlot法观察磷酸化S6K、AMPK和Akt及S6K、AMPK和Akt蛋白的表达。3、将NRK/RFP-LC3细胞或NRK52E细胞分为对照组,内质网应激组,内质网应激组+虫草素组,内质网应激组+虫草素+雷帕霉素组和雷帕霉素组或者分为对照组,内质网应激组,内质网应激组+虫草素组,内质网应激组+虫草素+Akti组和Akti组,并用相应试剂培养6小时。,观察自噬体的形成情况。用WesternBlot法观察LC3蛋白表达的情况。4、按上述分组培养48小时,观察细胞凋亡情况,计数凋亡细胞比率。结果:1、在内质网应激+虫草素组NRK52E细胞中,细胞凋亡减少,细胞形态基本正常。2、内质网应激+虫草素组中。RFP标记的LC3阳性颗粒明显减少。内质网应激组,S6K和Akt的磷酸化水平有所升高,内质网应激组+虫草素组,S6K的磷酸化水平高表达。磷酸化Akt的表达未能进一步增加。单独使用虫草素培养NRK52E细胞3小时后,磷酸化S6K和Akt表达明显升高。3、相较于内质网应激组+虫草素组,内质网应激组+虫草素+雷帕霉素组和内质网应激组+虫草素+Akti组中自噬体的形成明显减少,LC3-Ⅱ蛋白表达降低。4、相较于内质网应激组+虫草素组,内质网应激组+虫草素+雷帕霉素组和内质网应激组+虫草素+Akti组中细胞凋亡明显减少,凋亡细胞百分率明显下降。小结:1、虫草素可以抑制内质网应激引起的大鼠肾小管上皮细胞凋亡。2、虫草素可以抑制内质网应激引起的自噬过度活化。3、虫草素对自噬活化的抑制作用通过激活Akt-mTOR通路实现。4、阻断Akt-mTOR通路拮抗了虫草素对自噬的抑制作用,同时拮抗了虫草素对大鼠肾小管上皮细胞凋亡的抑制作用。
　　 结论:1、内质网应激可以诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡。2、自噬参与内质网应激诱导的细胞凋亡。3、虫草素可以抑制内质网应激诱导的细胞凋亡。4、虫草素通过活化Akt-mTOR通路抑制自噬,拮抗内质网应激诱导的细胞凋亡。