黑素瘤和色素痣BRAF、NRAS基因突变分析与黑素瘤血清microRNA肿瘤标志物研究

摘要

前言：
　　 恶性黑素瘤(malignant melanoma,MM)及色素痣(melanocytic nevi,MN)分别是黑素细胞性皮损的恶性及良性形式的典型代表。皮肤MM的发生率在不同人种间存在较大差异,以高加索人罹患率最高,东方人种次之,黑色人种最低。MN可以全身发生,高加索人发生频率高于亚洲及非洲有色人种。MN的发生也与年龄相关,一些病例发生在儿童期,但发生高峰多在30-40岁期间,然后随年龄增长发病率渐回落。
　　 BRAF是RAF家族成员之一,是RAS丝裂原活化蛋白激酶信号传导途径(RAS-RAF-MEK-ERK-MAP)中关键的丝氨酸/苏氨酸激酶。BRAF癌基因体突变,尤其是第15外显子T1799A(V600E)突变,在MM的各个阶段均有发现。同时,也有证据表明MN也存在BRAFT1799A突变,其频率高达80%。关于BRAFT1799A突变在MM发生发展过程中的真正角色,仍留有疑问。
　　 临床数据显示,日光,尤其是紫外线(ultravioletlight,UV)是引起MM或MN的最重要因素之一。来自于浅肤色的几个不同人群的研究显示间断性紫外线暴露与MM和MN中的BRAF突变显著相关。然而,紫外线暴露对于MM或MN发生的影响力可能受到不同皮肤类型和颜色的影响。
　　 除在原发性MM中检测BRAF突变外,更为广泛深入的研究也拓展到各类黑素细胞性标本中。Fullen等从68例Spitzoid皮损中的12例观察到了BRAF突变,其中2例是Spitzoid黑色素瘤,10例是Spitz痣。Gorden等发现40%(31/77)的侵袭性MM中存在BRAE突变。同时也有来自蓝痣及粘膜MM的报道。
　　 本研究收集了中国MM及MN标本,分析了BRAF突变发生规律。出乎意料的是,我们第一阶段的研究结果提示大量含有BRAF热点突变[第15外显子T1799A(V600E)]突变的MN并没有恶变成MM的临床和病理证据,而中国汉族MM中也鲜有该热点突变,不支持BRAF突变是MM发生发展的关键因素。
　　 目前,西方发达国家已经开发出针对.BRAF突变的药物并应用于临床治疗。然而,在具有BRAF高频突变的西方群体中,此类药物也未达到理想效果。提示围绕BRAF突变的治疗可能达不到预期目的。BRAF突变的生物学意义还有待商榷。早期诊断是提高存活率的最有效途径,早期发现皮损并移除可以拯救90%的患者。相反,随着疾病进展,5年存活率大大下降:Ⅱ期发现的患者5年存活率为60%,Ⅲ期则下降到10%;一旦转移,平均5年存活率仅为5%。
　　 MicroRNA(miRNA)是一大类仅有21-25nt的单链非编码小RNA,它通过与功能性mRNA3'端非编码区的非完全碱基配对来抑制相应mRNA的功能,发挥调节细胞分化、增殖或凋亡的作用。很有特点的是,50%的miRNA基因均定位于基因组上癌症基因相关区域。与正常组织相比较,在肿瘤中已经发现有差异表达的miRNA。数据显示,循环中存在来源于各种不同免疫细胞、组织或器官的miRNAs。数据显示循环体液中的miRNA可以抵抗非常极端的储存条件如存在RnaseA酶、煮沸、极端酸碱性储存液、延长存储时间及多次反复冻融等而依然保持稳定,为研究miRNA作为不同生理病理过程的基因标志奠定了基础。多篇报道指出血清miRNAs可以作为癌肿、炎症或心血管等疾病的检测标志。
　　 因此本小组将工作重心转移到寻找血清miRNA肿瘤标志物的方向中来。我们首先在小鼠黑素瘤模型中进行了初探。数据提示miR-103仅在朋M小鼠血清可以检测得到,而正常血清中则丰度极低(见第二部分);同时初步检测到在IvlM组小鼠和对照组血清间有差异表达miRNAs。强烈提示血清中可能存在MM肿瘤相关的miRNA,并可以用做区分标志。
　　 随即我们继续在MM患者血清里开始了同样的研究。可喜的是我们在MM血清中寻找到数个差异表达基因,部分表现为表达水平上的显著性差异,另一部分甚至在正常标本检测不到,而仅在MM血清特异表达的miRNA。经统计分析,数个miRNAs在区分MM与健康标本方面有较高的敏感性和特异性,极有潜力用作肿瘤标志物。
　　 尽管我们采用了年龄、性别无差异的34例MM和34例健康对照的相对大样本,该样本量仍不足以诠释候选miRNAs的表达与诸多不同MM病理类型和不同分期之间的关系。该研究结果还需要通过引入含有更多变量的更大规模样本进一步验证。而目前血清数据只能依赖高通量miRNAarray数据分析(仅高通量时才可应用全局标化分析),价格昂贵。在没有合适血清内参照基因的前提下,不便于进行单个具体miRNA的验证及扩大研究。
　　 多个研究小组仅单纯使用在细胞中稳定表达的基因如U6、miR-16、let-7α、RNU44或RNU48等,而数据表明snoRNA及RNU6B/U6在血清中表达并不稳定;miR-16和let-7α的差异表达甚至可以作为造血系疾病的诊断marker。因此,这些基因并不适合作为血清内参照基因用于相关数据分析。几个研究小组尝试应用外源性导入的与哺乳类生物基因序列相异的对照基因来标化循环中所得基因表达数据,如采用miR-54,cel-miR-39等基因。但是理论上来说,这些人为合成的miRNA仅可以帮助标化RNA提取过程中的技术方法差异。组织细胞中miRNA的含量仅有总RNA的0.01%,如此小的含量,在不同的标本间可能会有很大的差异,血清标本间的miRNA含量更甚。所以,人为添加的外源性小RNA是否能代表不同标本间的起始miRNA总量从而作为外源性对照基因尚有待进一步研究。
　　 为解决继续延伸MM血清肿瘤标志物研究过程中遇到的难题,我们进一步寻找血清中可能稳定表达适合用作内参照基因的miRNA。该研究将为最终寻找到MM病理及分期相关生物标志物奠定基础。
　　 材料与方法：
　　 一、实验对象
　　 从国内东北、西北及谣南地区有代表性的医院收集了组织病理诊断为MN或MM,福尔马林固定石蜡包埋的组织块,东北地区另有部分OTC包埋冰冻保存组织。绝大多数标本均来自当地汉族居民(仅1例彝族,3例藏族标本用于特殊分析),人口统计学信息来自当地病例记录档案。为探讨血清生物标识物的存在,从美国Jackson实验室购买C57BL/6(B6)小鼠,在HenryFordHealthSystemBioresources自行繁殖,B16F10黑素瘤细胞株接种后获得实验用血清。本研究中人血清标本分别购自Asterand(R)(Detroit,MI,USA)、BioreclamationLLC(Hicksville,NY,USA)以及InnovativeResearchInc(Novi,MI,USA)等公司,均取自高加索人,分别来自52例健康人、34例MM患者以及31例Ⅰ型糖尿病患者。
　　 二、实验材料
　　 常规生化试剂、QiagenDNA提取试剂盒、QiagenmiRNeasyMinikit、QIAquickGelExtractionKit、ABI公司TaqManMiRNA逆转录试剂盒、TaqManMiRNAMultiplexRTAssays,RodentpoolA和B(v2.0)、TaqManPreAmpMasterMix(2×)、MegaplexTMPreAmpPrimers(10×)forRodentpoolA和B(v2.0)、TaqManRodentMicroRNAarraycardv2.0,plateAandB、TaqManMiRNAMultiplexRTAssays,HumanpoolA(v2.1)和poolB(v3.0)、MegaplexTMPreAmpPrimers(10×)forHumanpoolA(v2.1)和poolB(v3.0)、TaqManHumanMicroRNAarraycard,poolA(v2.1)和poolB(v3.0)。
　　 三、实验仪器及软件
　　 MMI激光捕获显微切割系统、PCR自动循环仪9700型、ABI3730x1测序仪、7900HTFastReal-TunePCR仪、ABIVefitiThermalcycler、Nanodrop2000、UniversalVacuumSystemUVS400SpeedVac(R)Plus、SDS2.3、Rqmanager1.2、RealTmaeStatMiner4.2、Labworks4.0、Chromas2.31、SPSS18.0.0、GraphPadPrism5.0。
　　 四、实验方法
　　 染色后切片经显微切割获得目的组织,提取DNA,结合相应引物进行PCR扩增,产物进一步纯化后测序,将突变资料与各临床数据录入SPSS15.0进行统计分析。分类资料用卡方检验(据适用条件适当取Fisher精确概率分析结果)。同时进行多元Logistic回归分析并获取OR值(oddsratio)及95%可信区间,在此过程中,据适用条件用地区、性别、年龄、组织学类型或UV暴露模式进行数据校正。每个小鼠血清样本取100ul,人血清样本取200ul用于提取含miRNA的总RNA,富集浓缩后逆转录、预扩增并实时定量检测,从SDS2.3、Rqmanager1.2分析获取Ct值,导入RealTimeStatMiner4.2进行全局标化(Globalnormalization)分析。小鼠miRNA表达谱数据通过各组内miRNA相对表达值-△Ct想减获得-△△Ct差异表达值;人MM标志物检测相关数据使用StatMiner(R)4.2进行非参数Wilcoxon检验比较MM组与正常组之间的差异。假阳性率使用Benjamini-Hochberg进行校正,校正后P值小于0.01认为差异具有显著性。-△Ct导入GraphPadPrism@5.01生成点图。受试者操作曲线(Receiveroperatingcharacteristic,ROC)及其相应曲线下面积(Areaunderthecurve,AUC)使用SPSS18.0.0,用以分析候选miRNA作为肿瘤标志物的敏感性及特异性;人血清miRNA内参照基因相关数据使用StatMiner(R)4.2软件,分别用非参数Wilcoxon检验以及Limma校正t检验进行两两比较,不使用任何“假阳性率”校正。同时数据进一步导入SPSS18.0.0,进行单因素方差分析及获得基本统计描述数据,p＞0.1认为差异无显著性。使用Cluster3.0进行Complete-Iinkage及hierarchical聚类分析,分析所得数据导入Treeview1.6进行heat-map分析。寻找(1)在组别之间差异无显著性;(2)在不同样本间的表达值的变异很小,即△CT的标准差小于1(SD)以及(3)相对高表达,接近或高于全局标化的均值的稳定表达的miRNAs并同外源性掺入短片段基因进行比较。
　　 结果：
　　 一、恶性黑素瘤及色素痣中BRAF与MRAS突变分析
　　 1、中国汉族MN和MM中罕见BRAF第11外显子,NRAS第2、第3外显子突变
　　 2、中国汉族MN检出高频率BRAF15外显子T1799A突变
　　 中国汉族MN检出高频率BRA/15外显子T1799A突变,来自UV辐射强度较高地区的MN的突变率明显高于来自较低辐射强度区域的标本。不同组织学类型间突变率的差异具有显著性。所有三地标本中104例先天性MN与152例后天获得性MN中突变率未观察到明显差异(58.7%vs59.2%,P＞0.05)。突变发生与年龄相关,突变率高峰发生在20-30岁之间(27outof38,71.1%)。
　　 3、UV对BRAF突变的影响
　　 间断曝光部位的MN比频繁曝光部位(X2=5.23,P=0.022)及非曝光部位(X2=16.59,P=4.65E-5)具有显著高的突变率;而先天性痣中无差异。
　　 4、中国汉族MM含较低频率BRAFT1799A突变
　　 195例MM标本中,27例(15.0%)检测到BRAF突变。在标本数较多的东北(13.3%)、西北(16.9%)地区间,BRAF突变率没有显著性差异(X2=0.48,P=0.79)。并且突变率不受性别、发病年龄、UV曝光模式、组织学类型或侵袭深度(Breslow厚度)等影响(Chi-squaredtest,P＞0.05)。
　　 5、来自同一患者的标本基因型趋于一致。
　　 6、蓝痣、Spitz痣、转移瘤MM、粘膜MM中少见BRAF及NRAS突变
　　 二、MM小鼠血清差异表达miRNAs分析
　　 1、共检测到32个变化幅度高于4倍的差异表达基因,其中7个miRNAs上调表达。Mmu-miR-103、mmu-miR-467α*在小鼠MM血清中表达更高,但在正常血清中未检测到。23个miRNAs在小鼠MM血清中表达降低,多数低表达的miRNAs在MM肿瘤细胞株中表达也低于平均水平,半数低表达miRNAs在MM肿瘤细胞株中未检测出。
　　 三、人恶性黑素瘤血清miRNA诊断标志物研究
　　 1、血清RNA提取
　　 总RNA浓度约为2-8ng/l,溶于50ul无RNA酶去离子水,OD260/280比值约为1.0。真空浓缩后,浓度上升到约为10-20ng/ul,OD260/280比值不变,总体积减至6-10ul,峰值在270nm处。
　　 2、MiRNAarray及全局标化分析
　　 共检测到435个miRNAs,72个miRNAs可以在所有标本检测到,heat-map分析,显示多数miRNA表达趋势一致。
　　 3、全表达候选miRNA分析结果
　　 10个miRNA表达水平在MM和对照组间差异具有显著性,MiR-17-5p、miR-146a、miR-191、miR-590-5p和miR-151-3p在MM患者血清中表达水平显著升高;miR-30b、miR-30c、miR-150、miR-99b和miR-139-5p显著降低。所有10个候选基因均有很高敏感性和特异性,AUC≥0.75。
　　 4、部分表达候选miRNA分析结果
　　 对于仅在部分样本中可以检测到的miRNAs,18个miRNAs在两组间表达水平差异具有显著性,ROC曲线分析显示其miR-125α-3p、miR-605和miR-1303的AUC达到0.90以上。显示11个miRNAs在MM与对照组间的检出率有3倍以上差异。
　　 四、人血清miRNA内参照基因研究
　　 1、MiRNAarray及全局标化分析
　　 血清提取情况同前,117例血清标本A板共检测到332个miRNA,58个基因在所有标本中均能稳定检测到,全局标化后heat-map分析可见不同样本间多数miRNA表达趋势一致。
　　 2、miR-374α、miR-374b、let-7d在血清中表达相对稳定
　　 3、与外源性合成核酸片段比较
　　 本实验中两miRNAs的表达均相对稳定,平均表达值为has-miR-374α:28.98±0.78;cel-miR-39:31.07±0.55。
　　 4、目前常用的几个参照基因在血清中表达不稳定
　　 let-7α、RNU44以及RNU48仅能在部分样本检测到,U6变异程度较大,SD=2.85;miR-16类似,其SD=1.46。U6和miR-16在组别间差异具有显著性,p值均小于0.01。
　　 结论：
　　 1、中国汉族色素痣具有高频BRAFexon15T1799A突变,突变与紫外线暴露及皮损出现时间关系密切。较低发生频率的BRAFexon15T1799A突变并非中国汉族恶性黑素瘤发生的最关键因素。中国汉族色素痣及恶性黑素瘤均罕见NRAS突变,该族群与其他族群有一定差异。
　　 2、BRAFexon15T1799A突变的发生有个体易感性。该研究中所检测蓝痣、Spitz痣、粘膜黑素瘤及转移性黑素瘤等罕见BRAFexon15T1799A及NRASexon2突变,提示该人群黑素细胞性损害有特殊的发生发展机制。
　　 3、接种MM细胞的小鼠,血清miRNA表达谱发生变化,差异表达的miRNAs与MM细胞株中的miRNA的表达有一定程度的相关性,血清miRNA有潜力作为肿瘤标志物。
　　 4、MM患者与正常人血清miRNA表达谱相异,差异表达的miRNAs有潜力作为MM相关血清标志物。
　　 5、MiR-374α、miR-374b以及let-7d在血清中表达稳定,有潜力用作内参照基因以标准化其他血清miRNAs检测数据。