Egr-1特异脱氧核酶对大鼠颈总动脉球囊损伤术后PAI-1和TF表达的影响

摘要

前言:
　　 经皮腔内冠状动脉成形术(PCI)是目前广泛应用的治疗冠心病手段之一,但术后的再狭窄(restenosis,RS)影响了其远期疗效。研究发现,血管平滑肌细胞(VSMC)增殖所致血管内膜的增生是Rs的重要病理特征,而血管成形术后早期富含血小板的血栓形成与VSMC增殖、迁移和转型密切相关。纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)是调节纤溶活性的关键因子,早期血栓的发生和发展同PAI-1的水平和活性升高有关,抑制高活性PAI-1将对早期血栓形成及血管再狭窄的防治起到重要作用。TF,又称组织凝血活酶,是目前已知最有效的凝血途径天然启动子。PTCA术引起动脉血管内膜撕裂,使TF释放至血液,启动外源性凝血机制,从而导致局部血栓形成。TF除了有促凝作用外,它作为细胞膜的受体,可介导SMC的迁移和增生,促进Rs发展。脱氧核酶(deoxyribozyme,DRZ)是一种具有酶催化活性的DNA分子,作为一种基因抑制剂有着实际的治疗作用。早期生长反应因子-1(earlygrowthresponsefactor-1,Egr-1)是一种锌指结构转录因子。它在动脉损伤等外界刺激下被激活,在早期血栓形成、VSMC的分裂、增殖和内膜增生等过程有着重要的作用。本研究拟在建立血管球囊损伤实验动物模型的基础上,进一步观察Egr-1的特异脱氧核酶(10-23DRz,ED5)对大鼠动脉损伤后PAI-1及TF的作用,探讨其在血管损伤后抑制内膜增生的作用机制。
　　 材料与方法:
　　 一、合成ED5(由上海博亚生物技术有限公司合成),碱基序列为:5'-CCGCTGCCAGGCTAGCTACAACGACCCGGGACGT'-3,在其3’和5’端进行硫代修饰,5'端用FITC标记,以便于在荧光显微镜下观察转染后基因的分布情况。两侧下划线所示部分为寡核苷酸识别序列。
　　 二、实验分组及动脉损伤的模型建立和基因转染损伤动脉:
　　 96只雄性Wistar大白鼠,体重在350-400g,随机分为4组。A组为假手术组;B组为Mgd2对照组;C组为FuGene6对照组;D组为ED5+FuGene6转染组。
　　 用10%水合氯醛(0.3mg/g)麻醉后,于无菌条件下行颈正中切开,钝性分离左颈总动脉近心、远心端血流,用2F导管从颈外动脉插入左颈总动脉内,推入0.2mL生理盐水充盈气囊,反复抽拉球囊3次,造成左颈动脉内膜损伤。撤除球囊后,将200μl含有FITC-ED5500μg、转染试剂FuGene630μl、170μlImmol/LMgcl2的溶液局部注入至损伤的血管节段内,使其在局部作用20分钟。转染治疗基因24h后,取治疗组大鼠局部血管的冰冻切片置于荧光显微镜下,用470-490nm光激发,可见残存血管内膜及中膜较对照组有大量绿色荧光分布,证明转染成功,显微镜下观察荧光强度、分布并拍照。FuGene6组局部注入200μl含有转染试剂FuGene30μl、170μlmmol/LMgcl2的溶液:单纯损伤组局部注入200μl1mmol/LMgcl2液;假手术组只进行颈动脉结扎,但不插入导管。术后结扎颈外动脉,恢复血流,缝合颈部创口。术后局部使用青霉素以预防感染,喂食标准饲料,自由饮水。术后3、7、14、21d分批处死动物,处死前心脏采血用于ELISA检测。取病变处血管用于HE染色检测及免疫组化观察。
　　 三、所用试剂
　　 纤溶酶原激活物抑制剂1、组织因子ELISA试剂盒购至R&D公司;ED5购自上海博亚生物技术有限公司合成;转染试剂FuGene6购自Roche公司;Egr-1兔抗大鼠单克隆抗体购自Santacruz公司
　　 四、统计学处理
　　 所有数据采用SPSS13.0软件包进行统计分析,计量资料以均数±标准差(-x±s)表示,均数比较采用单因素方差分析,组间的多重比较采用LSD检验,P＜0.05为差异有显著性。
　　 实验结果:
　　 一、血管病理形态学改变
　　 光镜下可见:假手术组,血管内膜由一层完整的内皮细胞覆盖,无内膜增生;大鼠颈总动脉拉伤后,可见内皮剥脱,说明球囊拉伤内膜模型成功;血管损伤后3d可见Mgcl2对照组和FuGene6对照组内膜剥脱,尚无内膜形成,血管壁内膜附血小板血栓,ED5组无血栓形成;血管损伤后7天,Mgcl2组和FuGene6组血管内膜可见轻度增生,而ED5组不明显;损伤后14d内膜增生明显,内膜及中膜层有大量的增生细胞,排列紊乱,内弹力板模糊,两对照组比较差异无显著性;ED5组内膜增生明显减轻,差异有显著性(P＜0.01)。
　　 二、Egr-1免疫组织化学染色结果
　　 正常动脉Egr-1表达微弱,动脉损伤后3天、7天、14天至21天,呈持续高表达,经ED5作用后,Egr-1的表达下降,与同一时间点的Mgcl2组和FuGene6组比较差异有显著性(P＜0.01)
　　 三、ELISA结果分析
　　 (一)各组大鼠血浆PAI-1水平比较分析:
　　 正常血管PAI-1表达微弱;术后第3天血浆内PAI-1升高,14天开始逐渐下降。经ED5作用后,PAI-1的表达下降,与同一时问点的Mgcl2对照组、FuGene6对照组比较差异有显著性(P＜0.01)。两对照组之间PAI-1水平无明显差异(P＞0.05)。表明ED5在一定程度上抑制内皮损伤所诱导的PAI-1的高表达。
　　 (二)各组大鼠血浆TF的含量比较分析:
　　 用ELISA法测定不同阶段血浆TF表达量,结果显示正常血管TF仅少量表达,经球囊扩张后Mgcl2组、FuGene6组各时间点表达逐渐升高,明显高于假手术组(P＜0.01),Mgcl2组、FuGene6组比较无统计学意义(P＞0.05)。经ED5作用后TF表达水平较同期Mgcl2组、FuGene6组明显下降(P＜0.01)。
　　 讨论:
　　 本研究利用大鼠颈动脉损伤模型模拟人PCI术后再狭窄过程,以探讨血管内皮损伤与血浆内PAI-1、TF表达间关系及其在再狭窄发生发展中的意义,以及ED5的干预作用。
　　 PAI-1是血管损伤愈合中新生内膜形成的抑制性调节物,主要通过影响SMC迁移(而非增殖)起作用。球囊损伤后血血浆游离PAI-1水平升高,在局部减少纤溶酶原的激活,促进病变血管内纤维蛋白和ECM的堆积。PAI-1是纤溶酶原激活物的主要抑制剂,能调节纤溶活性和纤溶酶介导的细胞外基质金属蛋白酶的激活,它的高表达或活性增高可明显抑制ECM的降解,而且PAI-1与玻璃体连接蛋白结合后以更稳定的活性形式存在于ECM中,更有利于抑制ECM的降解促进RS形成。PAI-1亦参与VSMC的迁移和增殖的调节。这些均说明PAI-1在再狭窄的形成中起着重要的作用。
　　 TF是体内重要的生理性凝血过程启动子,血管损伤后,细胞表面的TF暴露,凝血系统在动脉局部被激活。TF除了有促凝作用,还可介导SMC的迁移和增生,促进RS发展。现有的绝大多数实验认为TF即可以来源于损伤局部的单核细胞,也可以来源于粘附聚集的血小板以及暴露于血液的平滑肌细胞,局部TF的水平可以作为内膜增生程度的预测因子。然而,除开血管局部以外,TF在外周血中也可以被探及(即血源性TF)。已经证实,血源性TF在局部血栓形成过程中起一定的作用。本实验观察了外周血TF水平与血管介入损伤后平滑肌细胞迁移增生的关系,发现中膜平滑肌迁移增生导致血管内膜增生,外周血TF表达的水平与内膜增生的程度存在正相关。对TF表达调控机制的研究,不仅仅会阐明新的内膜增生的分子机制,而且还有助于研发新的抑制内膜增生的理想药物。TF可能成为心血管病防治的新的药用靶点。
　　 脱氧核酶(deoxyribozyme,DRz)是一种具有酶活性的DNA分子,10-23DRz为其中之一,它具有磷酸酯酶活性,其两侧的底物识别序列可与RNA底物特异结合,而相对于催化特性结构域的底物RNA链中未与催化序列配对的嘌呤和配对的嘧啶残基之间,构成特异磷酸二酯酶切割位点,从而将底物RNA切断。ED5正是通过切割Egr-lmRNA,从而抑制Egr-1的表达,而阻遏动脉损伤后的内膜增生。
　　 已有研究表明,动脉损伤后,在许多被激活的活性物质中,Egr-1可能是一种实用而且理想的防止介入治疗后再狭窄的靶因子。这是因为Egr-1作为重要的核转录因子之一,偶联细胞外刺激与细胞内信号转导,介导30多种下游靶基因的表达,如诱导VSMC的增生和迁移、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等。ED5通过特异性抑制Egr-1的表达来阻遏下游靶基因的表达。目前已经明确PAI-1和TF的启动子中含有两个富含GC的Egr-1的结合位点,活化的Egr-1可以通过与这些位点的直接结合而调控其表达。因此ED5这种新型的RNA水平上的强效基因灭火因子,通过抑制Egr-1的表达,在某种程度上也抑制了PAI-1和TF的转录和表达,从而抑制动脉损伤后早期血栓形成及新生内膜的增生。
　　 病理学检查显示:与Mgcl2对照组和FuGene6对照组相比较,术后各时间点ED5转染组血管管腔再狭窄率显著减小(P＜0.01)。术后21天时,ED5组血管管腔的狭窄率比Mgcl2对照组和FuGene6对照组分别降低了58.90%和60.37%。血管球囊损伤后PAI-1表达的变化:正常血管PAI-1表达微弱;动脉损伤后3d,血浆内PAI-1升高,14天后逐渐下降。经ED5作用后,PAI-1的表达下降,与同一时间点的Mgcl2对照组、FuGene6对照组比较差异有显著性(P＜0.01)。正常血管TF仅少量表达,经球囊扩张后Mgd2组、FuGene6组各时间点表达逐渐升高,明显高于假手术组(P＜0.01),Mgcl2组、FuGene6组比较无统计学意义(P＞0.05)。经ED5作用后TF表达水平较同期Mgd2组、FuGene6组明显下降(P＜0.01)。考虑ED5可能通过抑制Egr-1的表达,下调PAI-1、TF表达,从而达到抑制早期血栓形成及新生内膜过度增生的作用。这与以往的有关ED5治疗基因抑制球囊损伤术后内膜增生有效性报道相一致,为ED5基因治疗再狭窄奠定了实验基础。
　　 结论:
　　 ED5可特异性的抑制Egr-1,下调PAI-1表达,减少TF激活,具有抗凝抗血栓防止内膜增生导致血管再狭窄的作用。