Pseudolaric acid B下调P-gp、Cox-2表达增加胃癌多药耐药细胞化疗敏感性

摘要

目的：
　　胃癌细胞的多药耐药(multidrug resistance，MDR)往往导致化疗无效或逐渐由有效转为无效，因此，寻找针对胃癌MDR细胞有效的药物及胃癌MDR的逆转剂，对提高胃癌的化疗效果、延长该类患者的生存期非常必要。
　　土槿皮乙酸(Pseudolaric acid B，PAB)是一种新型二萜酸化合物，是从松科金钱松属植物金钱松(Pseudolarix kaempferi Gorden)的干燥根皮或近根树皮（土槿皮）中分离出的，具有抑制多种肿瘤细胞增殖、诱导凋亡的作用。
　　研究显示PAB可抑制胃癌、肝癌细胞增殖并诱导凋亡，并可降低肝癌细胞内Cox-2的表达。近来发现其可降低乳腺癌细胞株MDA435/LCC6和肝癌细胞株QGY-TR50的耐药性，但其对胃癌细胞的MDR作用尚不清楚。本研究将探讨PAB对胃癌细胞MDR的作用及机制，并进一步阐明PAB在增加胃癌细胞化疗敏感性方面的作用。
　　方法：
　　1、MTT法检测细胞增殖抑制率
　　收集处于对数生长期的人胃癌多药耐药SGC7901/ADR细胞，调整细胞悬液浓度后接种到96孔板，待细胞贴壁后，实验组加入不同浓度的处理因素，对照组加等量不含药物的培养液，并设立调零孔。培养24、48小时后，MTT法检测各孔吸光度值（OD值），计算SGC7901/ADR细胞及SGC7901细胞生存率及抑制率，绘制生存曲线。
　　2、流式细胞仪检测细胞凋亡
　　收集处于对数生长期的人胃癌多药耐药SGC7901/ADR细胞，调整细胞悬液浓度接种于6孔板，细胞贴壁后加入不同浓度的PAB，并设立不加PAB的对照组。PAB处理24、48小时后消化收集各组细胞，AnnexinⅤ/FITC染色，流式细胞仪检测，分析细胞凋亡百分比。
　　3、共聚焦荧光显微镜观察细胞形态
　　收集处于对数生长期的人胃癌多药耐药SGC7901/ADR细胞，调整细胞悬液浓度接种于6孔板，以不同浓度PAB处理细胞24小时，Hoechst荧光染料染色，共聚焦荧光显微镜(×200)摄片，观察各组细胞形态。
　　4、Transwell小室检测PAB对细胞体外迁移及体外侵袭的影响
　　人胃癌多药耐药SGC7901/ADR细胞加入transwell小室中，不同浓度PAB处理各组细胞，24、48小时后计数穿膜细胞数，倒置荧光显微镜下(×100)摄片;transwell小室上层被覆Matrigel胶，SGC7901/ADR细胞加入小室中，不同浓度PAB处理各组细胞，24、48小时后计数穿膜及Matrigel胶细胞数，倒置荧光显微镜下(×100)摄片。
　　5、免疫细胞化学检测P-gp、Cox-2表达
　　人胃癌多药耐药SGC7901/ADR细胞爬片，细胞贴壁后以不同浓度的PAB，ADR及PAB联合ADR处理24小时，同时设立不加PAB的对照组，多聚甲醛固定，以免疫细胞化学法检测各组细胞内P-gp及Cox-2表达，显微镜下观察染色效果，显微镜下(×400)摄片。
　　6、Western blot方法检测Cox-2、PKC-α、MMP-9及MPGES-1蛋白的表达
　　收集不同浓度PAB干预的SGC7901/ADR细胞，及不加处理因素的SGC7901/ADR细胞，提取蛋白，用Western blot方法检测Cox-2、PKC-α、MMP-9蛋白的表达。
　　收集PAB，ADR，PAB联合ADR处理24小时后的人胃癌多药耐药SGC7901/ADR细胞，及不加处理因素的SGC7901/ADR细胞，提取蛋白，用Western blot方法检测MPGES-1蛋白的表达。
　　7、统计学处理
　　研究数据采用均数±标准差（x±S）表示，统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行，采用t检验及方差分析法进行差异性分析，P＜0.05为有显著差异。
　　结果：
　　1、人胃癌多药耐药细胞系的耐药性检测
　　MTT法分别检测ADR、5-FU、VCR三种常用化疗药对SGC7901/ADR细胞和SGC7901细胞的增殖抑制作用，结果显示SGC7901/ADR细胞和其亲本SGC7901细胞对三种化疗药对的敏感性有显著差异(P＜0.05或P＜0.01)，提示SGC7901/ADR细胞具有多药耐药属性。
　　2、PAB对人胃癌多药耐药SGC7901/ADR细胞的增殖抑制作用
　　MTT法检测发现PAB在0～250μmol/L浓度范围内，对人胃癌多药耐药SGC7901/ADR细胞的增殖有明显抑制作用（P＜0.05或P＜0.01），并呈浓度依赖关系(P＜0.05)，48小时后作用比24小时更加明显。
　　3、PAB对人胃癌多药耐药SGC7901/ADR细胞凋亡的检测
　　经5μmol/、10μmol/、20μmol/、60μmol/L的PAB处理24、48小时后，SGC7901/ADR细胞的凋亡率比对照组显著增加(p＜0.05或p＜0.01)，同时，PAB作用48小时后凋亡率比同一浓度24小时的凋亡率显著增加(p＜0.05或p＜0.01)。表明PAB0～60μmol/L范围之间以浓度依赖方式诱导SGC7901/ADR细胞凋亡。
　　4、共聚焦荧光显微镜观察SGC7901/ADR细胞形态
　　共聚焦荧光显微镜下观察到未经PAB处理的SGC7901/ADR细胞轮廓清晰，呈梭型贴壁生长，状态良好，细胞核正常，可见核分裂。经5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L的PAB作用24小时后细胞数量减少，可见核碎裂，固缩，部分核溶解，染色质边集，随着PAB浓度的增加，变化明显。从形态学上证实了PAB对SGC7901/ADR细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用。
　　5、PAB对胃癌多药耐药细胞体外迁移及侵袭的影响
　　Transwell小室法检测不同浓度PAB对人胃癌多药耐药SGC7901/ADR细胞迁移的影响，经检测2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的PAB有明显抑制SGC7901/ADR细胞迁移的作用，随着PAB浓度的增加，作用时间的延长，SGC7901/ADR细胞的穿膜细胞数逐渐减少，与对照组比较有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，提示PAB以浓度依赖方式降低SGC7901/ADR细胞体外迁移能力。
　　Transwell小室法检测人不同浓度PAB对人胃癌多药耐药SGC7901/ADR细胞侵袭的影响，经检测2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的PAB有明显抑制SGC7901/ADR细胞侵袭的作用，随着PAB浓度的增加，作用时间的延长，SGC7901/ADR细胞的穿膜及Matrigel胶细胞数逐渐减少，与对照组比较有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，提示PAB以浓度依赖方式降低SGC7901/ADR细胞体外侵袭能力。
　　6、PAB与常用化疗药对人胃癌多药耐药SGC7901/ADR细胞的协同作用
　　根据化疗药在体内的血浆峰值浓度，分别选择0.1倍、1倍、10倍及100倍血浆峰值浓度的ADR、VCR及5-FU。MTT法检测其单独应用及与亚剂量PAB联合应用对细胞的增殖抑制作用，金氏公式评价是否具有协同作用。
　　结果：显示亚剂量PAB与三种化疗药均有协同作用。
　　7、免疫细胞化学检测细胞P-gp、Cox-2表达
　　人胃癌多药耐药SGC7901/ADR细胞爬片后进行细胞免疫组化，显微镜下观察到SGC7901/ADR细胞有P-gp及Cox-2表达，经20μmol/L的PAB作用24小时后，P-gp及Cox-2的表达明显减少。
　　8、Western blot法检测Cox-2、PKC-α、MMP-9、MPGES-1蛋白的表达
　　Western blot检测发现SGC7901/ADR细胞可见Cox-2、MPGES-1、PKC-α及MMP-9蛋白表达，24小时后5μmol/L、10μmol/LPAB可明显下调Cox-2蛋白表达(P＜0.01)。10μmol/L PAB明显下调PKC-α蛋白的表达(P＜0.01)，10μmol/L、20μmol/LPAB下调MMP-9蛋白表达(P＜0.01)。表明PAB可通过下调Cox-2、PKC-α、MMP-9蛋白表达发挥对SGC7901/ADR细胞抑制增殖、诱导凋亡及抑制迁移与侵袭的作用。
　　结论：
　　1、PAB能抑制人胃癌多药耐药SGC7901/ADR细胞增殖、诱导凋亡，其机制为PAB下调Cox-2表达，抑制下游的PKC-α表达，减少了P-gp的表达，减弱P-gp介导的MDR，从而逆转SGC7901/ADR细胞的MDR。
　　2、PAB能降低SGC7901/ADR细胞体外迁移与侵袭能力，其机制为下调MMP-9的表达，破坏由细胞间基质和基底膜组成的细胞外基质，从而抑制细胞的迁移与侵袭。
　　3、PAB能增加人胃癌多药耐药SGC7901/ADR细胞对常用化疗药ADR、5-FU、VCR的敏感性，其机制为PAB抑制Cox-2及MPGES-1的表达，下调P-gp的表达，逆转MDR，增加SGC7901/ADR细胞对化疗药的敏感性。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 Pseudolaric acid B对SGC7901／ADR细胞体外增殖、凋亡的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文二 Pseudolaric acid B对人胃癌多药耐药细胞体外迁移和侵袭的影响及机制

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文三 Pseudolaric acid B对人胃癌多药耐药细胞的体外增敏作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 胃癌多药耐药的机制及逆转剂

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