肝细胞核因子4α在肝癌细胞表型转化和转移灶形成中作用的研究

摘要

研究背景及目的:
　　 肝癌是全球第六常见的肿瘤,也是全球第三的癌症致死病因。肝癌切除或肝移植是可治愈肝癌的主要方法。虽然外科手术技术以及围手术期治疗水平明显提高,但由于术后肿瘤转移复发,肝癌术后的长期生存率仍然较低。统计资料提示近年肝癌各种疗法的5年生存率(包括小肝癌)已接近高限,而瓶颈主要是转移复发。研究肝癌转移机制并寻找抑制肝癌转移形成的方法将会有效改善肝癌患者的预后。
　　 最近,研究发现间质上皮转化(MET)在肿瘤转移灶形成中起着重要作用,而对于肝癌细胞,仍缺乏充分证据证明这一点。肝细胞核因子4α(HNF4α)属于细胞核激素受体家族转录因子,在肝细胞和肝癌细胞分化及维持其上皮形态中起着重要作用。外源性表达HNF4α可使鼠去分化肝癌发生MET。而且,HNF4α可直接抑制EMT。主要调节基因Snail,Slug和HMGA,以及一些间质表型标志物基因的转录。因此,HNF4α再表达可能使肝癌细胞E钙粘蛋白表达上调,诱导其发生MET,进而促进肝癌肝内转移灶形成。本次实验旨在检测HNF4α表达改变对肝癌细胞表型和转移灶形成能力的影响,初步探索HNF4α以及细胞表型转化在肝癌转移灶形成中的作用。
　　 实验方法:
　　 1、肝细胞核因子4α在肝癌原发灶及转移灶组织中的表达及其与E钙粘蛋白表达关系的研究
　　 查找中国医科大学附属盛京医院石蜡包埋的具有肝癌转移灶组织标本的病例,制作普通的石蜡切片。用免疫组织化学染色方法分别检测每个肝癌组织中(包括原发灶及转移灶)HNF4α与E钙粘蛋白的表达情况。
　　 2、肝细胞核因子4α对肝癌细胞表型蛋白表达的影响
　　 细胞培养两种具有不同细胞表型的肝癌细胞系SK-Hep-1和Hep3B,提取细胞总蛋白,WesternBlot及免疫荧光检测两种细胞系HNF4α及细胞表型蛋白(钙粘蛋白、波形蛋白等)的表达水平。脂质体(Lipofectamine2000)法转染SK-Hep-1细胞HNF4α表达质粒,提取细胞总蛋白,WesternBlot检测SK-Hep-1细胞中HNF4α及细胞表型蛋白(钙粘蛋白、波形蛋白等)的表达水平变化。
　　 实验结果:
　　 1、肝癌转移灶处HNF4α和E钙粘蛋白表达水平高于原发灶,HNF4α和E钙粘蛋白表达水平之间具有正相关关系
　　 免疫组化检测肝癌原发灶及转移灶组织中HNF4α和E钙粘蛋白表达,HNF4α的表达呈核和/或浆阳性,E钙粘蛋白的表达呈膜和/或浆阳性。对HNF4α和E钙粘蛋白的表达进行评估发现,肝癌转移灶处HNF4α和E钙粘蛋白表达水平高于原发灶,Wilcoxon符号秩检验证明差异具有统计学意义(P＜0.05),而且肝癌原发灶及转移灶中HNF4α和E钙粘蛋白表达水平之间具有正相关关系(Spearman相关分析,P＜0.01,R=0.66)。
　　 2、肝细胞核因子4α可使间质表型的肝癌细胞系SK-Hep-1的E钙粘蛋白表达增加
　　 间质表型的肝癌细胞系SK-Hep-1细胞中,肝细胞核因子4α和E钙粘蛋白均低表达或无表达,而上皮表型的肝癌细胞系Hep3B细胞中肝细胞核因子4α和E钙粘蛋白均高表达,两者表达水平在肝癌细胞系中也具有正相关关系。肝细胞核因子4α表达质粒转染SK-Hep-1细胞后,WesternBlot检测见肝细胞核因子4α表达明显增加,而E钙粘蛋白表达也增高,证明肝细胞核因子4α对于E钙粘蛋白表达具有促进作用。
　　 结论:
　　 本研究结果显示,HNF4α和E钙粘蛋白在肝癌转移灶处表达增加,提示HNF4α和E钙粘蛋白可能参与肝癌转移灶的形成:肝癌组织中,HNF4α和E钙粘蛋白的表达水平存在正相关关系,提示HNF4α可能是调节肝癌原发灶和转移灶处E钙粘蛋白的表达变化的重要因素之一;肝癌细胞系中肝细胞核因子4α和E钙粘蛋白的表达存在明显正相关,通过质粒转染诱导肝癌细胞的肝细胞核因子4α表达增加,可增加肝癌细胞的E钙粘蛋白表达增加,证明了肝细胞核因子4α在肝癌细胞中对于E钙粘蛋白表达的调节作用;这些结果证明了肝细胞核因子4α可调节肝癌细胞表型转化,并可能参与肝癌转移灶形成。