MT1-MMP基因敲除细胞诱导性多能干细胞系的构建

摘要

目的：
　　 将外源性表达的转录因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和K1f4在体外转染到成纤维细胞中,使其重新编程为具有胚胎干细胞样状态的细胞,这种细胞命名为诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPS)。iPS细胞在形态学、增殖性、形成畸胎瘤、分化为三个胚层等方面与胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESC)高度的相似,用病人特异性的iPS细胞进行治疗会避免发生免疫排斥反应,同时也不会涉及损坏胚胎等伦理问题,为再生医学的研究和临床上进行细胞移植治疗提供实验依据。
　　 基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)在血管形成中起着重要的作用,目前已发现有25种MMPs,他们有着相同的结构以及相似的功能,但底物特异性是不同的。基质金属蛋白酶活性调节作用可发生在不同水平上,包括合成、分泌、激活和抑制。在血管形成过程中,降解细胞外基质促进内皮细胞的移行,形成管腔。膜型基质金属蛋白酶(Membrane-typematrixmetalloproteinases,MT-MMPs)是一种跨膜蛋白,它含有MMPs所有特征性的蛋白结构域,MT-MMP有六种亚型,MT1-MMP能够降解各种细胞外基质,包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ胶原、纤连蛋白、纤维蛋白等,在血管和骨形成过程中发挥重要作用。本实验将外源性表达的转录因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4在体外转染进入C57BL/6J和MT1-MMP基因敲除鼠的成纤维细胞中,使其重新编程为诱导性多能干细胞,通过观察该细胞形态、ES细胞特异性抗原的表达以及增殖分化能力鉴定iPS细胞。MT1-MMP-/-iPS细胞系的建立为研究MT1-MMP在血管及骨形成中的功能提供了一个良好的细胞模型。
　　 方法：
　　 1、质粒转染将pMXs-Oct3/4、-Sox2、-c-Myc和-Klf4四种质粒在大肠杆菌扩增、提取;Plat-E细胞系包装培养、收集上清液;提取C57BL/6J小鼠和MT1-MMP基因敲除小鼠的成纤维细胞以密度8×104/ml细胞数接种于100mm的培养皿中,加入pMXs-Oct3/4、-Sox2、-c-Myc和-Klf4四种质粒包装成病毒的上清液,放入37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养,每天换液一次,两天后接种到铺有STO细胞的培养皿中,隔天换液。
　　 2、细胞形态学观察在光学倒置显微镜下观察转染后的克隆形成情况,挑取克隆,传代培养,观察iPS细胞的形态。
　　 3、碱性磷酸酶染色用碱性磷酸酶染色鉴定iPS细胞。
　　 4、免疫荧光检测用免疫荧光检测iPS细胞的ES细胞特异性标志SSEA-1和Oct3/4表达情况。传代的iPS细胞,弃液、清洗、固定、透化、封闭后,同时加入SSEA-1和Oct3/4作为一抗,以PE标记的IgG作为二抗,激光共聚焦显微镜下观察。
　　 5、PCR检测MT1-MMP在构建的iPS细胞中的表达提取细胞的总DNA,PCR方法进行扩增,产物进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统扫描拍照。
　　 6、RT-PCR检测Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的mRNA的表达提取细胞的总RNA,将其逆转录为cDNA,PCR方法进行扩增,产物进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统扫描拍照。
　　 7、Westernblotting检测MT1-MMP蛋白的表达提取细胞的总蛋白,用Westernblotting检测细胞MT1-MMP蛋白表达情况。
　　 8、iPS细胞诱导分化培养用心肌和内皮细胞诱导分化培养基将iPS细胞以密度8×104/ml;悬滴法形成拟胚体后,向诱导心肌细胞和内皮细胞分化,用细胞免疫荧光法检测心肌细胞特异性标志物肌钙蛋白I和内皮细胞早期特异性标志物Flk-1表达情况。
　　 结果：
　　 1、细胞形态学观察C57BL/6J和MT1-MMP基因敲除小鼠的成纤维细胞转染逆转录病毒包装好的Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的DNA,约两周后形成细胞克隆,传代后培养可见ES样细胞克隆。
　　 2、碱性磷酸酶染色传代后的iPS细胞用碱性磷酸酶试剂盒进行染色,可见稳定转染的细胞呈蓝紫色。
　　 3、免疫荧光检测传代的iPS细胞明显表达ES细胞特异性抗体SSEA-1和Oct3/4。
　　 4、C57BL/6J小鼠和MT1-MMP基因敲除小鼠的成纤维细胞以及两种iPS细胞的分子生物学特征在MT1-MMP基因敲除小鼠的成纤维细胞和其形成iPS细胞中未见Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的表达;而在两种iPS细胞中,可见特征性基因Oct3/4、Sox2、e-Myc和Klf4的表达。
　　 5、Westernblotting检测MT1-MMP蛋白的表达C57BL/6J小鼠的成纤维细胞和其形成的iPS细胞有MT1-MMP蛋白的表达,而MT1-MMP基因敲除小鼠的成纤维细胞及其iPS细胞中,没有MT1-MMP蛋白的表达。
　　 6、体外iPS细胞诱导分化培养用心肌和内皮细胞诱导分化培养基将iPS细胞悬滴法形成拟胚体后,接种于24孔板,约12天后,向心肌细胞分化的拟胚体周围出现跳动区域。诱导的跳动心肌细胞用免疫荧光可检测到心肌特异性标志物肌钙蛋白I阳性表达,分化的内皮细胞表达早期特异性标志物Flk-1。
　　 结论：
　　 1、C57BL/6J小鼠和MT1-MMP基因敲除小鼠的成纤维细胞可重新编程为iPS细胞。
　　 2、MT1-MMP基因敲除小鼠的成纤维细胞重新编程的iPS细胞MT1-MMP蛋白表达缺失。
　　 3、重新编程的iPS细胞在体外可被诱导分化为心肌和内皮细胞。