RGC32基因在肺腺癌中表达改变的分子机制及其对肺腺癌A549细胞化疗敏感性的影响

摘要

目的：
　　肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤，在恶性肿瘤中的死亡率居首位，且呈逐渐上升趋势，其中腺癌占40％以上。手术切除配合放、化疗是目前治疗肺癌的主要手段，但肺癌的高复发率、高病死率都是目前治疗上存在的难题。所以，加强肺癌发病原因分子机制的研究尤为迫切。前期的检测发现肺腺癌组织中RGC32基因存在表达异常。RGC32为重要的补体应答基因，在细胞增殖分化、炎症反应、肿瘤发生和转移等过程中起关键作用，从而参与人类许多疾病的发生发展过程。本研究拟检测RGC32基因在肺腺癌组织中的表达，明确其表达发生改变的原因;应用RNA干扰技术沉默肺腺癌A549细胞中RGC32蛋白的表达，检测RGC32沉默对A549细胞凋亡、细胞生长抑制率和化疗敏感性的影响，并探讨p38信号通路在其中发挥的作用。
　　方法：
　　Real-time PCR检测32例肺腺癌组织表达中的RGC32 mRNA表达。TargetScanHuman5.1等软件预测能够调控RGC32基因的micro-RNA，Real-timePCR检测肺腺癌组织中miR-656表达。检测miR-656前体对RGC32基因表达的影响。应用荧光素酶报告基因表达分析明确miR-656是否与RGC32基因3'UTR结合，负性调控RGC32基因的表达。
　　应用Real-time PCR和Western blot验证siRNA-RGC32对A549细胞中RGC32基因的沉默效果。应用MTT法及流式细胞仪观察RGC32基因沉默的A549细胞增殖情况和细胞凋亡情况;研究RGC32基因表达沉默是否能够提高化疗药物DDP对A549细胞的作用效果。应用Western blot法检测RGC32基因沉默时磷酸化p38蛋白在A549细胞表达的改变，并应用p38抑制剂SB203580抑制p-p38，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
　　结果：
　　1、肺腺癌组织中RGC32 mRNA的表达
　　Real-time PCR检测32例肺腺癌组织表达中的RGC32 mRNA表达。结果显示，与癌旁组织相比，肺腺癌组织中RGC32 mRNA表达明显增加。
　　2、miR-656调控RGC32基因表达
　　应用TargetScanHuman5.1等软件，预测RGC32基因是miR-656的靶基因，在RGC32 mRNA-3'UTR有miR-656结合位点。Real-time PCR检测发现，与癌旁组织相比，肺腺癌组织中miR-656表达明显增加。而且RGC32与miR-656的表达水平呈明显负相关。miR-656前体能够显著降低RGC32基因的表达。荧光素酶报告基因表达分析证实miR-656能够与RGC32基因3'UTR结合，负性调控RGC32基因的表达。
　　3、RGC32基因表达沉默对A549细胞生物学性状的影响
　　Real-time PCR和Western blot检测证实，siRNA-RGC32能够显著抑制A549细胞中RGC32基因的表达。而RGC32基因表达沉默能够显著地抑制A549细胞的增殖能力，促进A549细胞凋亡。
　　4、RGC32基因表达沉默对A549细胞化疗敏感性的影响
　　RGC32基因表达沉默能够显著地提高化疗药物DDP对A549细胞的作用效果，DDP处理后的RGC32基因表达沉默的A549细胞的增殖能力进一步降低，凋亡率进一步增加。
　　5、p38/MAPK通路在RGC32基因调控A549细胞凋亡中的作用。
　　Real-time PCR和Western blot检测证实，RGC32基因表达沉默能够显著上调A549细胞中p-p38蛋白的表达。应用p38抑制剂SB203580抑制A549细胞中上调的p-p38，A549细胞的凋亡率显著降低。
　　结论：
　　1、RGC32基因在肺腺癌中表达显著上调，miR-656在肺腺癌中表达显著降低，RGC32与miR-656的表达水平呈显著地负相关。
　　2、miR-656能够通过与RGC32基因3'UTR特定序列靶向结合并负性调控RGC32基因的表达。
　　3、RGC32基因在肺腺癌细胞中能够调控细胞增殖和凋亡等生物学行为，能够提高肿瘤细胞对化疗药物DDP的敏感性，发挥癌基因的作用。
　　4、RGC32基因能够通过p38/MAPK通路参与调控肺腺癌细胞凋亡等生物学特性。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 RGC32基因在肺腺癌中表达改变的分子机制

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 RGC32基因对肺腺癌A549细胞增殖凋亡及化疗敏感性的影响

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 microRNAs的功能及其在癌症中的作用

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