过量氟对大鼠生长板软骨病理学改变及对Ihh、PTHrP mRNA表达的影响

摘要

前言:
　　 氟是人体必需的微量元素之一,对人体健康具有双重作用,适量的氟是人体必须的,是构成骨骼和牙齿的重要成分,并能够促进生长发育和生殖功能。但长期摄入过量的氟可引起以氟斑牙和氟骨症为主的慢性全身性疾病。
　　 氟骨症是一种慢性地方性骨关节病,主要侵害四肢关节的骨、软骨和骨周组织,导致关节功能障碍,严重者可致脊柱和四肢关节畸形。国内外研究报道,饮高氟水的实验大鼠生长板软骨细胞增多。生长板是软骨内成骨的主要发生部位,正常长骨的纵向生长有赖于生长板软骨细胞的不断增殖和分化,所以生长板发育直接关系到长骨的生长发育。因此推测,过量氟可通过干扰软骨内成骨过程造成骨骼生长发育障碍。流行病学调查结果也证实:高氟饮水延缓儿童骨骼发育成熟,表现为骨龄延迟且高氟对青春发育期的儿童影响更为明显。
　　 软骨内成骨过程受全身内分泌(包括激素、生长因子)和局部旁分泌及自分泌等多种生长因子的调控,它们对于软骨的形成和生长发育的平衡起着重要作用。在局部旁分泌生长因子中,IndianHedgehog(Ihh)信号起关键作用,是调控软骨细胞增殖和分化的核心。Ihh通过三种作用机制调控软骨内成骨过程:通过Ihh/PTHrP信号负反馈通路调控软骨细胞的分化;直接调控软骨细胞的增殖以及调控软骨膜向成骨细胞分化。
　　 由于生长板剥离比较困难,以往国内有学者就氟对软骨的影响进行了形态、生化或组织化学研究,但对于分子生物学机制的研究很少。鉴于Ihh信号通路的作用在氟中毒所致软骨损伤中的研究仍未见报道,因此我们通过实验建立氟中毒大鼠模型,观察生长板软骨的病理学改变,通过检测Ihh、PTHrPmRNA的表达水平,探讨Ihh信号通路在生长板软骨细胞增殖、分化中的作用,为阐明氟中毒对生长板软骨损伤机制提供新的线索。
　　 材料与方法:
　　 一、动物分组
　　 断乳1周雄性Wistar大鼠32只,体重50～80g,按体重随机分成4组,分别饮用自来水配制的不同浓度的含氟水。四个剂量组分别为:对照组(饮用自来水含氟离子0.118mg/L),低氟组(饮水含氟离子50mg/L),中氟组(饮水含氟离子100mg/L),高氟组(饮水含氟离子150mg/L)。
　　 二、实验方法
　　 1、染氟大鼠一般状况观察
　　 整个实验周期内,观察染氟大鼠的生长发育状况,每周测量并记录大鼠体重,同时观察大鼠氟斑牙的发生情况。
　　 2、大鼠体内氟负荷测定
　　 大鼠体内氟负荷以血清氟和骨氟含量表示。血清氟含量采用酸消化扩散法测定。骨氟含量采用管式炉高温燃烧水解法-氟离子选择电极法测定。
　　 3、HE染色及图像分析
　　 大鼠解剖分离胫骨后,固定3天,脱钙,石蜡包埋,冰冻切片,制成5μm石蜡切片,用于HE染色。低倍镜下(10×)观察,通过ImageJ图像分析软件测量生长板厚度、增殖细胞层及肥大细胞层厚度,同时计数增殖层和肥大层细胞层数,取其平均值。以上测量均采用盲法。
　　 4、软骨组织总RNA的提取
　　 将生长板软骨研磨成粉末状后,采用常规的RNA提取方法,以RNAisoTMPlus来提取生长板软骨组织中的RNA。
　　 5、Real-timePCR
　　 取软骨组织总RNA2μl,测RNA浓度。RT总反应体系10μl。PCR总反应体系25μl,具体步骤如下:cDNA2μl,SYBRPremixExTaqⅡ10μl,上下游引物(10μm)各0.8μl,Rox0.4μl,补水6μl,混匀于0.5ml八联管中。
　　 三、统计分析方法
　　 用SPSS13.0统计软件进行统计分析,用Kolmogorov-Smimov进行数据正态性分析。组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),用LeveneStatistic进行方差齐性检验,两两比较采用LSD-t检验;相关分析用PearsonCorrelation。以p<0.05作为组问差异有统计学意义的判定标准。
　　 实验结果:
　　 1、染氟大鼠的一般状况
　　 对照组大鼠皮毛光泽,活动度好;染毒组大鼠皮毛失去光泽,且精神状态较差,活动度减少,个别大鼠出现被毛脱落。对照组与实验组大鼠相比体重没有显著性变化(p>0.05)。实验期间各染氟组大鼠均出现氟斑牙情况,并随着染氟剂量的升高,氟斑牙的损伤逐渐加重。
　　 2、染氟大鼠血清氟和骨氟测定
　　 染氟3个月后,各染氟组大鼠血清氟和骨氟含量显著高于对照组(p<0.01),而且随染氟剂量增高,血清氟和骨氟含量逐渐升高。经Pearson相关分析,血清氟、骨氟含量与染氟剂量呈明显的正相关关系。
　　 3、过量氟对生长板软骨组织病理学的影响
　　 (1)染氟大鼠生长板软骨形态学变化
　　 低倍镜下(10×)可见,对照组大鼠生长板软骨边缘基本整齐,细胞呈柱排列。随着染氟剂量增加,各染氟组表现为生长板增厚、弯曲,增生层和肥大层软骨细胞堆积,且排列紊乱,呈舌状向干骺端伸入,个别大鼠可见生长板过度增厚现象。
　　 (2)大鼠生长板形态学计量结果
　　 各染氟组生长板厚度均高于对照组,差异具有显著性(p<0.01)。随着染氟剂量的增加,各染氟组增殖细胞层与肥大细胞层厚度也随之增加,增殖细胞层厚度与对照组相比差异具有显著性(p<0.05或0.01),150mg/L染氟组肥大细胞层厚度与对照组相比增加明显(p<0.05)。我们通过对增殖细胞层与肥大细胞层厚度的比例计算发现,该比值有增高趋势,说明增殖细胞与肥大细胞增殖分化过程中原有的平衡被打破。各染氟组增殖细胞层和肥大细胞层数均出现不同程度的增加,且随着染氟剂量增高增加更明显(p<0.01)。经Pearson相关分析,生长板厚度、增殖层、肥大层厚度与染氟剂量均呈明显的正相关关系;增殖层、肥大层细胞层数与染氟剂量均呈明显的正相关关系。
　　 4、染氟对Ihh、PTHrPmRNA表达的影响
　　 各染氟组IhhmRNA表达水平高于对照组,150mg/L染毒浓度IhhmRNA表达水平与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05)。PTHrPmRNA的表达水平高于对照组,呈升高趋势,但没有显著性差异(p>0.05)。经Pearson相关分析,IhhRNA相对表达含量与染氟剂量呈明显的正相关关系。
　　 结论:
　　 1、过量氟可以造成大鼠生长板软骨细胞损伤,表现为生长板增厚(增殖层、肥大层均增厚)。
　　 2、过量氟可通过刺激Ihh、PTHrPmRNA表达水平,造成生长板软骨增殖、分化失衡。