牙乳头细胞对大鼠牙髓干细胞增殖及分化的影响及机制研究

摘要

目的：
　　牙病或外伤等原因引起的牙齿缺失可导致牙槽骨萎缩、相邻牙齿松动脱落等症状，直接降低人们的生活质量和影响容貌美观。活动义齿、固定义齿和种植义齿是最常见的修复缺失牙齿方法，然而他们各有弊病。近年来国内外学者已经成功地应用组织工程技术研制出具有生物活性的牙齿部分组织，选择合适的细胞团或种子细胞是实现牙齿再生重建的前提。牙髓干细胞(Dental pulp stem cells，DPSCs)是牙髓组织中具有高度增殖、自我更新能力和多相分化潜能的一类成体干细胞。DPSCs体外培养可分化为成牙本质样细胞，并分泌牙本质或牙本质样物质，复合到支架材料上可形成牙本质-牙髓样组织。DPSCs作为组织工程的种子细胞之一，对牙齿的修复再生及牙齿组织工程相关研究具有重要意义。
　　Gronthos等将人的第三磨牙牙髓进行原代培养，分离DPSCs并将其置于含矿化液的培养液中，待形成矿化结节后将其与羟基磷灰石-磷酸三钙(HA-TCP)支架复合，再将其移植到免疫缺陷小鼠的背部皮下，6周后内形成牙本质样结构环绕在牙髓样组织周围形成牙本质牙髓样复合体。研究表明，影响DPSCs增殖分化的因素包括碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）、骨形成蛋白(bone orphogeneticproteins，BMPs)、β-磷酸甘油、Dentonin等等。牙乳头细胞也是组织工程牙齿的一类种子细胞。牙髓牙本质复合体是形成牙齿的前体。而牙乳头内含有向成牙本质细胞分化的前体细胞，即牙乳头细胞可以作为牙髓牙本质复合体的前身。Kikuchi等研究表明牙乳头中存在能分化为成牙本质细胞的干细胞。另有研究表明体外培养的牙乳头细胞不仅可以分化为成牙本质细胞，还可以诱导形成成牙本质基质。增强种子细胞的增殖活性和分化能力是构建组织工程牙齿、推动牙齿再生研究的重要条件。DPSCs和牙乳头细胞在适宜的诱导环境中增殖能力和矿化能力均较强，均有分化成牙本质细胞的潜能，而牙乳头细胞在体外与DPSCs分层混合培养对DPSCs增殖、分化能力的影响目前还未见报道。
　　DPSCs的增殖、分化受Notch、Wnt等多种信号转导通路调节。Notch途径是一种进化高度保守的细胞间信号途径，主要作用是抑制各种干细胞的分化，促进其分裂增殖。研究表明，Notch信号分子通过和Delta或Jagged结合，影响DPSCs的增殖和分化，参与上皮细胞与问充质细胞间的通讯联系，促进成釉细胞和成牙本质细胞的分化。Wnt信号通路在牙齿发育的信号调控和牙齿再生等医学工程研究中亦发挥重要作用。Wnt信号中的重要因子wnt-1，APC，β-catenin，E-cadherin可影响牙上皮和间充质的相互作用及牙本质与牙根的发育、增殖和分化。
　　本研究拟分离培养大鼠DPSCs与牙乳头细胞，并建立DPSCs和牙乳头细胞的分层共培养体系，探讨大鼠牙乳头细胞对DPSCs增殖及分化的影响及相关牙齿发育信号通路的机制研究。此研究国内外尚未见报道。我们首先建立DPSCs和牙乳头细胞的分层共培养体系，观察体外分层共培养的细胞矿化结节形成情况，并利用流式细胞术检测DPSCs的细胞周期，利用RT-PCR、免疫细胞荧光化学方法、Western blot检测牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)、角蛋白(cytokeratin，CK)、Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ，COLⅠ)等基因与蛋白的表达，观察分层共培养是否能促进这些成牙标志性蛋白的表达。明确牙乳头细胞是否可以促进DPSCs的增殖、分化，从而促进其成牙能力。最后研究DPSCs和牙乳头细胞的分层共培养下，给予Notch信号通路抑制剂异硫氰酸苯已酯(PHI)和Wnt信号通路抑制剂Dickkopf-1(DKK-1)干预DPSCs，检测DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ基因和蛋白的表达。并观察细胞中Notch、Wnt信号通路中的信号分子Notch1、Notch2、Jagged1、wnt-1，APC，β-catenin基因和蛋白的表达变化。本研究结果能够明确大鼠牙乳头细胞是否促进DPSCs的增殖与分化及其分子机制，这为牙齿再生的研究提供新的实验依据和新思路。
　　方法：
　　1、DPSCs和牙乳头细胞的分层共培养。
　　2、von Kossa矿化染色。
　　3、利用流式细胞术检测DPSCs的细胞周期。
　　4、利用免疫细胞化学方法检测DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ蛋白的表达。
　　5、RT-PCR法检测DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ mRNA的表达。
　　6、Western blot法检测DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ蛋白的表达。
　　7、DPSCs和牙乳头细胞的分层共培养下，给予Notch信号通路抑制剂PHI和Wnt信号通路抑制剂DKK-1干预DPSCs，RT-PCR法和Western blot法检测DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ mRNA和蛋白的表达。
　　8、DPSCs和牙乳头细胞的分层共培养下，RT-PCR法和Western blot法检测细胞Notch信号通路中Notch1，Notch2，Jagged1，DLL1，Hes1 mRNA和蛋白表达。
　　9、DPSCs和牙乳头细胞的分层共培养下，RT-PCR法和Western blot法检测细胞Wnt信号通路中wnt-1，APC，β-catenin，E-cadherin mRNA和蛋白表达。
　　结果：
　　1、分层共培养14天后，DPSCs中可观察到明显的矿化结节。
　　2、流式细胞术结果显示分层共培养可促进DPSCs的增殖。
　　3、分层共培养细胞5天后，DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ mRNA的表达显著增加。
　　4、DPSCs和牙乳头细胞的分层共培养下，给予PHI和DKK-1干预DPSCs，RT-PCR法和Western blot法结果显示DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ mRNA和蛋白的表达显著下降。
　　5、DPSCs和牙乳头细胞的分层共培养下，RT-PCR法和Western blot法显示细胞Notch信号通路中Notch1，Notch2，DLL1，Jagged1，Hes1 mRNA和蛋白表达增强。
　　6、DPSCs和牙乳头细胞的混合培养下，RT-PCR法和Western blot法显示细胞Wnt信号通路中wnt-1，β-catenin mRNA和蛋白表达增强;E-cadherin，APCmRNA和蛋白表达和对照组比较无统计学意义。
　　讨论：
　　本实验结果显示大鼠牙乳头细胞和DPSCs分层共培养14天后，DPSCs中可观察到明显的矿化结节，分层共培养组细胞的增殖较单纯DPSCs培养对照组增殖显著旺盛，即牙乳头细胞和DPSCs分层共培养可促进DPSCs的增殖。利用RT-PCR、免疫细胞荧光化学方法、Western blot证实了牙乳头细胞和DPSCs分层共培养可增加成牙标志性蛋白DSPP、CK、COLⅠ mRNA和蛋白的表达。该结果首次证明牙乳头细胞可以促进DPSCs的增殖、分化，从而促进其成牙能力。同时本研究结果显示给予Notch信号通路抑制剂PHI和Wnt信号通路抑制剂DKK-1干预DPSCs，DSPP、CK、ColⅠ基因和蛋白的表达减弱，提示Notch和Wnt信号通路可能参与了牙乳头细胞促进DPSCs的增殖、分化。本研究结果并进一步明确牙乳头细胞可能促进Notch信号通路中的信号分子Notch1，Notch2，DLL1，Jagged1，Hes1及Wnt信号通路中的信号分子wnt-1，β-catenin表达上调诱导DPSCs的增殖与分化。
　　恒牙出现缺损缺失时，需要以人工修复体恢复口腔功能和面容美观。随着生物组织工程技术的进步，人们开始设想如何对牙齿能够进行生物克隆或再生，干细胞理论、组织重组以及生物支架材料的应用，使人们有了希望去实现牙齿再生。2000年Gronthos等人成功的从人牙髓组织中提取出具有克隆源性且能快速增殖的DPSCs细胞群，将其种植于免疫缺陷小鼠的体内，可以培养出牙本质牙髓样物质。
　　综上所述，本研究结果证明大鼠牙乳头细胞和DPSCs分层共培养，牙乳头可能分泌一些可溶性因子促进DPSCs的增殖、矿化与分化，并增加成牙标志性蛋白DSPP、CK、COLⅠ mRNA和蛋白的表达;Notch和Wnt信号通路可能参与了牙乳头细胞促进DPSCs的增殖、分化的过程。
　　结论：
　　1、牙乳头细胞和DPSCs分层共培养可促进DPSCs矿化、增殖及分化
　　2、牙乳头细胞和DPSCs分层共培养可促进DPSCs中DSPP、CK、ColⅠ mRNA和蛋白的表达。
　　3、DPSCs和牙乳头细胞分层共培养时可能通过激活Notch、Wnt信号通路，促进DPSCs的增殖、分化。
　　4、DPSCs和牙乳头细胞分层共培养时可能通过激活Notch信号通路中Notch1，Notch2，DLL1，Jagged1，Hes1 mRNA和蛋白表达促进DPSCs的增殖、分化。
　　5、DPSCs和牙乳头细胞分层共培养时可能通过激活Wnt信号通路wnt-1，β-catenin mRNA促进DPSCs的增殖、分化。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 牙乳头细胞对大鼠牙髓干细胞增殖及分化的影响

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 牙乳头细胞对大鼠DPSCs增殖及分化的作用机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 牙齿再生的研究进展

致谢

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