IgG Fc段编码基因对日本脑炎DNA疫苗细胞免疫增强效应的影响

摘要

目的：
　　 比较IgG Fc段编码基因不同构建方式对乙脑DNA疫苗诱导特异性免疫的效应，为JE DNA疫苗的研制提供研究依据。
　　 材料和方法：
　　 一、实验材料
　　 1.细胞与实验动物
　　 鼠肥大细胞瘤细胞(P815)于中国医科大学感染科实验室冻存;BALB/c雌性小鼠，4～6周龄，体重18～20g，购自中国医科大学盛京医院动物实验室。
　　 2、质粒与菌株
　　 JEV prME基因的重组质粒被命名为pJME，pJME/IgG Fc段融合质粒，均由本实验室构建;真核表达载体pcDNA3.1(+)由本实验室冻存;大肠杆菌购自Takara公司。
　　 3、主要试剂
　　 高纯度质粒大提试剂盒购自TIANGEN生化技术有限公司;限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、以及NotⅠ等均购自Takara公司，用于扩增质粒的酶切鉴定;氨苄青霉素购自Sigma公司;琼脂糖购自Takara公司;乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒购自Promega公司，用于检测免疫鼠脾CTL活性;rhIL-2购自上海普欣生物技术有限公司;免疫荧光的抗体（CD16/32，CD4-FITC，CD8-PE）均购自美国BD PharMingen公司，用于检测脾脏T淋巴细胞亚群变化;红细胞裂解液购自碧云天生物技术公司，用于提取小鼠脾脏T淋巴细胞;10％胎牛血清(fatal calf serum，FCS)购自海克隆公司，RPMI-1640细胞培养液购Hyclone公司。
　　 二、实验方法
　　 1、重组表达载体的大量提取与纯化:
　　 根据TIANGEN高纯度质粒大提试剂盒，大量提取pJME、pJME/IgG、pIgG Fc共3种质粒。并用紫外分光光度计检测质粒DNA浓度与纯度，最终调整质粒浓度为1μg/μL。
　　 2、动物和免疫程序:
　　 将BALB/c小鼠随机分为7组，每组小鼠5只，分别将溶于100μL生理盐水的不同免疫原肌肉注射鼠后肢肌肉，包括:pJME、pJME/IgG Fc、 pJME+pIgG Fc、pcDNA3.1(+)（阴性对照组）、JE灭火疫苗组（阳性对照组，剂量相当于1/5成人剂量）。共免疫3次，间隔2周
　　 3、小鼠脾脏细胞的分离
　　 断颈处死小鼠后无菌取脾;将脾脏置于盛有RPMI-1640的平皿中，去脂肪和结缔组织，无菌注射器芯研磨过200目钢网，4℃，10，000rpm，离心10分钟;继用红细胞裂解液溶破红细胞，4℃，1000rpm，离心10分钟，后弃上清;PBS洗2次，每次以800rpm，离心5分钟，弃上清。PBS重悬细胞后制成细胞浓度为1×106/ml的新鲜脾细胞悬液。
　　 4、将制备的脾细胞悬液，用流式细胞仪分析其中的T淋巴细胞亚群的特点，LDH释放法检测CTL活性。
　　 1、质粒的酶切鉴定结果
　　 pIgG Fc经过EcoRⅠ/NotⅠ酶切释出的插入子与IgG Fc基因(729bp)大小相一致，pJME经过EcoRⅠ/BamHⅠ酶切释出的插入子与IgG Fc基因(2001bp)大小相一致，pJME/ IgG Fc经NotⅠ/BamHⅠ酶切释出的插入子为(2730bp)，是鼠IgG Fc编码基因与JEV prME蛋白编码基因之和。
　　 2、脾脏CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群分析: pJME/IgG Fc组CD4+T淋巴细胞比例为(66.64±5.84)％，明显高于其他组(P＜0.05)，pJME+pIgG Fc组CD4+T淋巴细胞比例(60.55±2.09)％，高于pJME组(52.86±1.92)％，也高于JE灭活疫苗组(55.77±1.62)％(P＜0.05)，pcDNA3.1(+)组CD4+T淋巴细胞比例为(37.82±4.93)％，明显低于其他组(P＜0.05)。
　　 3、CTL杀伤活性的测定:
　　 各组免疫鼠CTL活性由高至低依次为:pJME/IgG Fc组46.92±1.97％、pJME+pIgG Fc组40.44±0.69％、pJME组34.36±2.14％、JE灭火疫苗组25.29±1.26％、pcDNA3.1(+)组6.62±3.85％，各组见比较，差异有统计学意义，(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 1、IgG Fc段编码基因能显著提高CD4+T淋巴细胞比例。
　　 2、IgG Fc段编码基因能够增强T细胞对靶细胞的细胞毒效应。
　　 3、相对于pJME+pIgG Fc联合免疫组，pJME/IgG Fc融合质粒免疫组能够诱导更强的细胞免疫反应。

目录

声明

摘要

英文缩略词

论文

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

在校期间科研成绩

致谢

个人简介