脑微血管内皮细胞中淀粉样前体蛋白(APP)的表达及其加工研究

摘要

目的:
　　 阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)是以渐进性记忆力和智能减退为特征的弥漫性中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)退行性疾病。它是引起老年人群痴呆的最常见原因,并随着人类寿命的延长,发病率呈明显增高趋势,患者通常在发病后数年内死亡。
　　 AD主要的组织病理特征为:大脑皮质和海马神经细胞外β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein,Ap)沉积形成的老年斑和脑神经细胞内tau蛋白异常聚集形成神经纤维缠结。研究表明,AD中85%-95%的病人合并有脑血管淀粉样血管病(cerebral amyloid angiopathy,CAA);在AD转基因小鼠模型中也发现有不同程度的脑微血管病变,可能参与了AD的病理进程。然而,目前对脑微血管参与AD进展的机制知之甚少。
　　 β淀粉样蛋白是阿尔茨默海病脑内沉积的主要病理性蛋白,Aβ的形成、聚集和清除贯穿了AD的整个病理过程。Aβ是由淀粉样蛋白前体(APP)经蛋白水解酶作用后的产物。在体内,APP有两条主要代谢途径。其一是Ap代谢途径:即APP首先经经β分泌酶切割产生一较长的N端片段(sAPPβ)和一个较短的跨膜片段C99,然后再经γ分泌酶切割,产生含有39-42个氨基酸的Aβ和一胞内片段AICD(APPintracellulerdomain,AICD)。其二是非Aβ代谢途径:即APP先由α分泌酶切割,产生较大的可溶的氨基端片段(sAPPα)和一跨膜片段C83,后者同样经γ分泌酶作用产生较小的片段p3和AICD。目前国内外的研究大多关注表达于神经元中的APP,尤其是神经元中的APP加工产生Aβ的机制和意义。然而,作为神经.血管单元中的重要组分,脑微血管中是否存在APP及其代谢过程,进而参与AD的病理进程,值得探讨。
　　 在本研究中,我们首先检测了体外正常培养条件下,人脑微血管内皮细胞中APP及其相关分泌酶的表达情况。我们在发现人脑微血管内皮细胞中能够表达APP及其相关分泌酶的基础上,通过血清饥饿处理人脑微血管内皮细胞,进一步分析了应激状态下人脑微血管内皮细胞中APP代谢过程的变化。
　　 方法:
　　 1、RealtimePCR、Westernblot和免疫荧光技术鉴定APP及其相关分泌酶在人脑微血管内皮细胞中的表达。
　　 2、以血清饥饿处理人脑微血管内皮细胞,RealtimePCR和Westernblot方法初步分析.APP,α-分泌、β分泌酶及γ分泌酶的表达变化。
　　 3、ELISA方法检测血清饥饿的人脑微血管内皮细胞中AB及sAPP的分泌情况。
　　 4、Westernblot方法分析sAPP在血清饥饿的人脑微血管内皮细胞中的表达。
　　 5、RealtimePCR和Westernblot方法分析血清饥饿后仅.分泌酶(ADAM9,ADAM10以及ADAM17)的表达变化。
　　 结果:
　　 1、在人脑微血管内皮细胞中存在APP及其代谢相关分泌酶
　　 (1)在人脑微血管内皮细胞中,检测到了APP的mRNA,以及α分泌酶(ADAM17)、β分泌酶(BACEl)及γ分泌酶(PS1,PS2,Nicastrin,APH-1及PEN-2)的mRNA。
　　 (2)在人脑微血管内皮细胞中,检测到了APP,BACE-1和PS2的蛋白表达。
　　 2、血清饥饿可以上调人脑微血管内皮细胞中APP的表达
　　 (1)血清饥饿人脑微血管内皮细胞后,APP的mRNA表达升高,且呈时间依赖性。
　　 (2)血清饥饿人脑微血管内皮细胞后,APP的蛋白表达升高,且呈时间依赖性。
　　 3、血清饥饿对人脑微血管内皮细胞Aβ的产生没有影响
　　 4、血清饥饿可以促使人脑微血管内皮细胞分泌可溶性APP
　　 (1)血清饥饿处理后,人脑微血管内皮细胞向培养液上清中分泌的可溶性APP增多,且呈时间依赖性;
　　 (2)血清饥饿处理后,人脑微血管内皮细胞中表达的可溶性APP增加,且呈时间依赖性;
　　 5、血清饥饿导致人脑微血管内皮细胞中α分泌酶ADAM10、ADAM17表达升高
　　 (1)血清饥饿可以促使人脑微血管内皮细胞中ADAM10和ADAM17的mRNA表达升高,而对ADAM9的表达没有影响;
　　 (2)血清饥饿可以促使人脑微血管内皮细胞中ADAM10和ADAM17的蛋白质表达升高。
　　 结论:
　　 1、在人脑微血管内皮细胞中存在APP及其代谢加工过程;
　　 2、血清饥饿处理人脑微血管内皮细胞后,可以选择性增强APP的非Ap代谢途径,促使可溶性的APP(sAPP)分泌增加。