关于Aβ3-10多价DNA疫苗的构建及其对幼年鼠脑内老年斑沉积和记忆障碍的预防作用的研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种中枢神经系统退行性疾病，临床表现为进行性记忆力丧失和认知能力减退，病理学表现为形成以β-淀粉样蛋白(Aβ)沉淀为特征的老年斑，神经元内tau蛋白异常聚集形成纤维缠结，脑皮质、海马胆碱能神经元及其突触数量减少，累及的皮层动脉和小动脉出现血管淀粉样变性。近年来由于分子生物学的证据，Aβ毒性学说得到了大多数学者的认同，减少Aβ沉积及加速其降解成为预防和治疗AD的重要目标。主动免疫和被动免疫均有报道能够显著减少老年斑沉积，降低神经元水肿和星形胶质细胞增生，同时带来记忆功能的改善。
　　 1999年，Schenk等首次发现，当Aβ接种AD转基因鼠时能够诱发明显的抗体反应同时减少鼠脑内Aβ的沉积。外周应用抗Aβ抗体同样可以清除已经存在的Aβ的沉积。2000年，Janus等证实在TgCRND8转基因小鼠接种Aβ42也可以减少脑内Aβ的沉积，Morris水迷宫试验证实改善记忆功能，Aβ疫苗治疗作用可能不是通过改善总水平，而是通过调控Aβ毒性物质的活性和非活性状态。
　　 基于先前的报道，AN1792Ⅰ期临床试验取得成功，而Ⅱ期临床试验却因无菌性脑膜炎和局部出血性脑中风血管病的发生被迫中止。研究者们认为脑膜脑炎的可能与目标抗原决定簇引起的Th1型免疫反应和传统佐剂QS21有关。研究发现，Aβ氨基酸末端发现一B淋巴细胞抗原决定簇，与全长Aβ1-42相比，引起Aβ转基因小鼠发生T淋巴细胞发生炎症反应的可能性减少，由于Aβ正常情况下被认为是自身抗原，所以Aβ免疫动物使用佐剂可促进抗原抗体反应。
　　 据目前的报道对已有抗原刺激的动物慢性给予褪黑素能够激活Th2型免疫反应，抑制Th1型免疫反应。在癌症的化疗过程中，褪黑素通过刺激内源性IL4来完成集落刺激活性和挽救造血功能，发现其在诱导GM-CSF分泌中也有一定作用，IL-4和GM-CSF，IL4和GM-CSF作为Th2型佐剂已被广泛使用。应用褪黑素引起的强大的免疫增强作用在于褪黑素增强了抗原与免疫活性细胞之间的递呈，增强了体液免疫，在免疫初始调节了细胞因子的分泌，建立了一个重要细胞水平的控制。有研究显示在有抗原预先刺激的小鼠早期给予褪黑素可以显著降低IL-2和TNF-γ的产生，极大增加IL-4的分泌，褪黑素的高水溶性和脂溶性使其极易通过血脑屏障，分布于每个细胞，避免了细胞因子作为佐剂全身给药的毒副反应。褪黑素作为机体内一种激素，抑制Aβ毒性作用的同时能够起到增强Th2型免疫反应的佐剂作用，其双重性决定了将其应用于AD疫苗的合理性。
　　 由于pcDNA3.1含有人类巨细胞病毒的高效启动子和增强子，是一种外源基因在哺乳动物细胞中高效表达的理想载体。为此，我们拟构建pcDNA3.1(+)-(Aβ3-10)10重组质粒并以肌肉注射的方式免疫AD双转基因鼠(APPswe/PS1)，同时以腹腔注射的方式给小鼠注射褪黑素MT，探讨其在AD的预防及治疗方面的效果，及其是否出现脑内炎症反应，希望能为我们解决目前AD疫苗存在的免疫原性差和不良反应等问题，成为阿尔茨海默病的特异性疫苗。
　　 实验方法：
　　 人工合成重复10次的Aβ3-10片段(Aβ3-10)10，克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，酶切位点为HindⅢ和BamHⅠ。重组质粒转化大肠杆菌DH5α扩增并大量提取。重组质粒经琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定。脂质体方法将质粒转染HEK293细胞。用Western blotting方法及肌肉免疫组化检测表达产物。将重组质粒p(Aβ3-10)10-MT用电穿孔的方法肌肉注射免疫BALB/c小鼠，Aβ42肽及pcDNA3.1(+)分别作为阴性和阳性对照。ELISA的方法测定免疫后血清中的抗体滴度、抗体分型及体外脾细胞培养上清中的细胞因子。免疫组化的方法检测抗血清对APP/PS1转基因鼠脑Aβ斑的识别。用p(Aβ3-10)10-MT免疫APP/PS1转基因鼠，ELISA的方法测定免疫后血清中的抗体滴度、抗体分型、脾细胞培养上清中的细胞因子及鼠血清和脑组织中的Aβ含量。水迷宫的方法检测转基因鼠的学习记忆能力。免疫组化的方法检测鼠脑内的老年斑、星形胶质细胞、小胶质细胞及鼠脑内的炎症反应，普鲁士蓝染色法检测微出血的发生，免疫荧光双标记检测老年斑与小胶质细胞含量之间的关系。
　　 实验结果：
　　 一、质粒成功构建并转染HEK293细胞
　　 重组质粒成功构建，经酶切及测序鉴定序列正确。成功转染HEK293细胞，Western及肌肉免疫组化成功检测其蛋白表达。
　　 二、重组质粒免疫BALB/c小鼠的免疫效果
　　 1、血清抗体及分型测定
　　 重组质粒p(Aβ3-10)10-MT组及Aβ42组免疫BALB/c小鼠后均产生了较高滴度的血清抗体，Aβ42组抗体滴度高于p(Aβ3-10)10-MT组，而pcDNA3.1(+)质粒组未产生抗Aβ抗体。p(Aβ3-10)10-MT免疫BALB/c鼠后产生的抗体IgG1/IgG2a比值约是Aβ42组的5倍。
　　 2、重组质粒免疫后BALB/c小鼠脾细胞培养上清的细胞因子检测
　　 经相应抗原刺激后脾细胞培养上清中，Aβ42组及p(Aβ3-10)10-MT组的IL-4的含量均明显高于pcDNA3.1(+)组。Aβ42组的IFN-γ的含量明显高于p(Aβ3-10)10-MT组及pcDNA3.1(+)组。
　　 3、抗血清与APP/PS1转基因鼠脑内的老年斑相结合
　　 经免疫组织化学染色证实重组质粒p(Aβ3-10)10-MT免疫BALB/c小鼠后产生的抗血清能与10月龄的APP/PS1转基因鼠脑内的老年斑相结合。
　　 三、重组质粒免疫APP/PS1转基因鼠的免疫效果
　　 1、血清抗体及分型测定
　　 重组质粒p(Aβ3-10)10-MT组及Aβ42组免疫APP/PS1转基因鼠后均产生了较高滴度的抗Aβ抗体，Aβ42组抗体滴度高于p(Aβ3-10)10-MT组，而pcDNA3.1(+)质粒组未产生抗Aβ抗体。p(Aβ3-10)10-MT组免疫后产生的抗体以IgG1为主，IgG1/IgG2c比值约是Aβ42组的4倍。
　　 2、脾细胞培养上清的细胞因子检测
　　 ELISA显示经相应抗原刺激后脾细胞培养上清中，Aβ42组及p(Aβ3-10)10-MT组的IL-4的含量均明显高于pcDNA3.1(+)组。Aβ42组的脾细胞培养上清中IFN-γ的含量最高，明显高于p(Aβ3-10)10-MT组及pcDNA3.1(+)组。而p(Aβ3-10)10-MT组和pcDNA3.1(+)组的脾细胞培养上清中IFN-γ的含量没有差别。
　　 3、免疫接种对APP/PS1转基因鼠的学习记忆能力影响
　　 Morris水迷宫实验:可视平台训练中，三组小鼠的潜伏期无统计学差异。隐藏平台试验中，Aβ42组和p(Aβ3-10)10-MT组潜伏期远远小于空质粒组，而Aβ42组和p(Aβ3-10)10-MT组之间差别无意义。在空间探索试验中，Aβ42组和p(Aβ3-10)10-MT组小鼠在平台所在象限时间及穿越平台的次数要远远大于空载体组，而Aβ42组和p(Aβ3-10)10-MT组之间差别无意义。
　　 4、血清抗性的检测
　　 Western发现当6E10被应用时，Aβ单倍体，三聚体，四聚体被视为大片段聚合物，p(Aβ3-10)10-MT组免疫后的血清能够较强地与Aβ单倍体，三聚体，四聚体相结合，而不能与Aβ多聚体很好地结合，与6E10抗体所提示的结果相类似。同样，免疫组化结果显示p(Aβ3-10)10-MT组免疫后的血清能够很好地与AD转基因鼠脑内老年斑相结合，而空质粒组则不能识别AD转基因鼠脑内的老年斑。
　　 5、脑组织及血清中可溶性Aβ42检测
　　 Aβ42组及p(Aβ3-10)10-MT组脑匀浆中的不溶性Aβ42分别降低43.3％及32.5％，与空质粒相比，可溶性Aβ42在Aβ42组及p(Aβ3-10)10-MT组脑匀浆显著升高，而两组之间差异没有统计学意义。血浆中的Aβ42水平表现出与脑内的可溶性Aβ42水平相似的模式。
　　 6、免疫后APP/PS1鼠脑内的老年斑、星形胶质细胞、小胶质细胞、淋巴细胞浸润及微出血的免疫组化结果
　　 用免疫组化及定量分析方法。Aβ42组及p(Aβ3-10)10-MT组海马及皮层Aβ斑与pcDNA3.1(+)组相比明显减少。与老年斑结果一致，Aβ42组及p(Aβ3-10)10-MT组海马及皮层的GFAP阳性细胞及Iba1阳性细胞与pcDNA3.1(+)组相比明显减少。 p(Aβ3-10)10-MT组与pcDNA3.1(+)组脑内无明显CD3或CD4阳性表达细胞。而Aβ42组脑组织中可见大量CD3和CD4阳性的细胞。Prussian染色显示Aβ42组免疫有微出血的发生，而p(Aβ3-10)10-MT组与pcDNA3.1(+)组则未检测到微出血。
　　 结论：
　　 1、DNA疫苗p(Aβ3-10)10-MT免疫BALB/c小鼠和APP/PS1转基因鼠后都能够产生高滴度的抗Aβ抗体，并且免疫反应类型为Th2型。
　　 2、DNA疫苗p(Aβ3-10)10-MT免疫APP/PS1转基因鼠可以延缓APP/PS1转基因鼠的空间学习记忆的能力的下降。
　　 3、DNA疫苗p(Aβ3-10)10-MT免疫APP/PS1转基因鼠成功地预防了其脑内皮层及海马区的老年斑的沉积，同时减少小胶质细胞及星形胶质细胞的数量，脑内无明显T淋巴细胞浸润，无微出血。

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摘要

英文缩略语

论文一 关于Aβ3-10多价DNA疫苗的构建及其免疫BALB／c鼠作用的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 Aβ3-10基因疫苗对幼年鼠脑内老年斑沉积预防作用的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

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