锌转运体ZnTs在小鼠内分泌细胞中的表达及ZnT8参与睾酮合成的分子机制

摘要

前言:
　　 锌是哺乳动物中含量第二丰富的微量元素，参与许多生物学功能，包括:生长，发育，生殖，免疫等。锌在人和动物的新陈代谢中发挥重要作用，从生化学角度，锌参与调控300多种酶，这些酶参与中间代谢，DNA和RNA合成，基因表达和免疫活性;从激素的稳态角度，锌也具有重要作用，锌和几乎所有的激素可以相互作用。密切相关的有:甲状腺素，甲状旁腺激素，胰岛素，垂体激素，雄激素和雌激素等。锌离子在胰岛β细胞中高表达，并且在胰岛素分泌小泡中参与胰岛素结晶，也参与垂体中催乳素和肾上腺皮质激素的分泌。锌缺乏使血清中甲状腺素T3水平下降，同时抑制雄性激素和雌激素的合成与分泌。大量的研究表明，锌同男性生殖的健康和疾病也有着密切的关系。睾酮的合成需要多种与锌有关的酶的参与才能完成，在睾丸Leydig细胞中，睾酮是由胆固醇经一系列酶催化作用转化而成的，细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc)，3羟甾脱氢酶(3βHSD)，细胞色素P45017α-羟化酶(P450α17)和17β-羟甾脱氢酶(17ββHSD)这4种酶是睾酮生成的基本酶。因而锌缺乏可使睾酮合成减少，并且缺锌对睾丸有特殊损害作用，锌缺乏状态下，实验动物间质细胞坏死，数量减少，影响Leydig细胞产生和分泌睾酮。缺锌还可导致DNA、RNA聚合酶活性降低，DNA、RNA和蛋白质合成障碍，使细胞增殖受阻，胆固醇催化酶活性降低，也影响促性腺激素的分泌，睾酮及其运输载体蛋白的合成，最终导致睾酮合成障碍。
　　 锌离子不能通过被动扩散跨越生物膜，在哺乳动物中由锌转运体(ZnTsand Zips)来调节锌离子的跨膜运动，锌转运体ZnT家族是一组具有六个跨膜区域并富含组氨酸的结构和功能相近的蛋白质，其主要功能是促进细胞质内的锌离子转运到细胞膜外或者转运到胞内细胞器中，从而达到降低胞内锌离子的作用。ZnT家族包含10个家族成员，即ZnT1-10，它们与锌离子稳态调节密切相关。ZnT家族的表达与分布具有组织特异性。近年研究表明，ZnT8主要定位于胰岛β细胞的分泌囊泡膜上，由369个氨基酸组成，是胰岛的特异性锌离子转运蛋白。其功能是特异性的向分泌囊泡内转运锌离子，使锌离子在囊泡内聚集，调节胰岛素的合成、储存和分泌。近期研究表明，ZnT8也表达在胰岛α细胞和其他内分泌细胞，包括甲状腺滤泡上皮细胞和肾上腺皮质细胞。ZnT8与内分泌系统的功能密切相关，这提示其他ZnTs是否也与内分泌细胞密切相关。同时，锌转运蛋白1、3、7、8在男性生殖系统均有表达。此前的研究中证实小鼠睾丸中ZnT7表达广泛，并且ZNT7和锌离子分布在曲细精管内不同种类的细胞中。此前，研究中证实ZnT7将细胞质内锌离子转运进高尔基体，并可能参与了高尔基体对蛋白质的修饰加工。这也提示与内分泌密切相关的ZnT8是否与雄激素睾酮的合成和分泌具有相关性。
　　 睾丸间质细胞合成的睾酮是确保精子生成、维持正常性欲和雄性第二性征所必需的类固醇激素。大部分睾酮由睾丸的间质细胞产生，睾丸中的睾酮水平是血清中的睾酮水平的10倍。LH/hCG是调节睾酮生物合成的主要激素， LH/hCG调节睾酮合成包括快速和慢性两种作用方式。LH/hCG刺激LH受体30-60分钟后，导致cAMP的水平快速和慢性上升，随后PKA被激活，激活的PKA信号诱导EGFP非依赖性配体所导致的MAPK信号通路的激活。MAPK的激活导致现有的少量StAR磷酸化和转移到线粒体内膜，引起类固醇的生成增多。但是LH/hCG调节睾酮合成的快速作用机制目前还不是很清楚。在慢性调节期，间质细胞需要LH/hCG保持其完全分化的结构和功能，2小时之后，慢速PKA信号导致StAR的mRNA转录水平升高，随后StAR蛋白表达增高，MAPK的显著信号不再引起StAR磷酸化和转移到线粒体内膜。StAR蛋白(Steroidogenic Acute Regulatory Protein，类固醇合成快速调节蛋白)是调节这一步骤的关键性因子。文献证实，幼年及成年小鼠或者大鼠注射生理剂量的LH/hCG后，可诱发血清睾酮浓度上升。体外原代培养的睾丸间质细胞，给予LH/hCG刺激后，可分泌睾酮，并在一定范围内，分泌睾酮量与LH/hCG的浓度呈正相关。
　　 综上所述，锌在内分泌细胞中丰富表达，为深入探讨锌在内分泌细胞中锌稳态的内在机制和ZnTs在内分泌细胞中的表达与分布，并验证锌和ZnTs与相关激素的合成和分泌的相关作用。本研究以CD1小鼠为实验对象，检测锌和ZnT1-10在小鼠垂体、肾上腺、甲状腺、胰腺、睾丸和卵巢中的表达和分布;同时本实验旨在探讨ZnT8介导的锌离子转运参与hCG诱导的小鼠睾丸间质细胞的睾酮生成的影响及其机制，并进一步验证ZnT8介导睾酮的生成是通过快速通路还是慢性通路，以及锌及ZnT8影响睾酮合成时所作用的相关酶，从而揭示ZnT8参与类固醇激素合成过程中的证据及机制。
　　 实验方法:
　　 1、锌和锌转运体ZnTs在小鼠内分泌细胞中的表达与分布的研究
　　 28只CD1小鼠（8-10周，重约30克，雄性14只，雌性14只），应用金属自显影(AMG, autometallography)检测zinc在具有内分泌功能的器官（垂体，肾上腺，甲状腺，胰腺，睾丸和卵巢）中的分布。应用Real time PCR和免疫组化技术检测ZnTs mRNA和蛋白在上述具有内分泌功能的器官中的表达和分布。
　　 2、锌转运体ZnT8参与睾酮分泌的分子机制研究
　　 雄性CD1乳鼠（15天，重约9克）给予hCG处理后，应用共聚焦激光扫描显微镜检测ZnT8与StAR在睾丸间质细胞中的表达与分布;应用AMG和免疫组化技术等检测hCG对乳鼠血清睾酮浓度，睾丸间质细胞锌离子，ZnT8表达的影响。小鼠睾丸间质细胞瘤细胞（MLTC-1）给予高锌、低锌、ZnT8过表达质粒转染和siRNA干扰处理后，检测孕酮水平，cAMP，PKA活性的水平，以及锌离子分布的变化;应用Western blot技术检测ZnT8、StAR和P-StAR以及睾酮合成过程快速通路和慢性通路中的酶的表达，以及cAMP-PKA途径和MAPK通路中的相关蛋白的表达。
　　 实验结果:
　　 一、锌和锌转运体ZnTs在小鼠内分泌细胞中的表达
　　 1、ZnT1-10 mRNA在小鼠具有内分泌功能的器官（垂体，肾上腺，甲状腺，胰腺，睾丸和卵巢）中的表达
　　 Real time PCR结果显示，ZnT1-10 mRNA在小鼠具有内分泌功能的器官（垂体，甲状腺，胰腺，肾上腺，睾丸和卵巢）中均有表达，但是表达含量不同，只有ZnT10 mRNA在胰腺中没有表达。ZnT1 mRNA在垂体和甲状腺中高表达，在胰腺表达量最低。ZnT2 mRNA在垂体和卵巢中表达量相对最低。ZnT3 mRNA的表达量在甲状腺和睾丸中较高，在垂体，胰腺，肾上腺和卵巢中表达量极低，几乎检测不到。ZnT4 mRNA和ZnT6 mRNA在检测的器官中表达情况相似，甲状腺和睾丸中高表达，ZnT4 mRNA在卵巢中次之，也高于其他器官，其余器官的表达水平相似，而ZnT6 mRNA在垂体和卵巢中表达高于胰腺和肾上腺。ZnT5 mRNA表达量在垂体，甲状腺，胰腺，睾丸，肾上腺和卵巢中依次递减。ZnT7 mRNA在睾丸中表达最高，垂体和胰腺次之，在其余器官中低表达。ZnT8 mRNA的表达水平在胰腺中最高，在其他的内分泌器官也有表达，但是表达水平显著低于胰腺。ZnT9mRNA丰富表达在垂体和卵巢，高于其他器官的表达水平。ZnT10 mRNA在被检测器官中的表达水平最低，低于其他的ZnTs mRNA，ZnT10 mRNA在垂体中相对高表达，在胰腺中不表达。
　　 2、ZnT1-10蛋白在小鼠具有内分泌功能的器官（垂体，肾上腺，甲状腺，胰腺，睾丸和卵巢）中的分布
　　 (1) ZnTs蛋白在腺垂体中的分布
　　 除了ZnT10，其他ZnT1-5，ZnT7和ZnT8蛋白均分布在腺垂体的嗜酸性细胞和嗜碱性细胞胞质中，ZnT3-5和ZnT8在嫌色细胞中也有阳性反应，但是ZnT1，ZnT2与ZnT7只有微弱阳性染色或阴性的反应。
　　 (2) ZnTs蛋白在肾上腺中的分布
　　 所有的ZnTs均在肾上腺中表达，ZnT1，ZnT3，ZnT4，ZnT7和ZnT8分布在肾上腺皮质的球状带，束状带和网状带细胞中，ZnT2，ZnT5和ZnT10在球状带的阳性反应较弱，ZnT1，ZnT3，ZnT7和ZnT8在肾上腺髓质中高表达，ZnT4，ZnT5和ZnT10在肾上腺髓质中呈阴性反应。
　　 (3) ZnTs蛋白在甲状腺中的分布
　　 除了ZnT10，其他ZnT1-5，ZnT7和ZnT8蛋白均分布在甲状腺滤泡上皮细胞和滤泡旁细胞的细胞质中。
　　 (4) ZnTs蛋白在胰腺中的分布
　　 除了ZnT10，其他ZnT1-5，ZnT7和ZnT8蛋白在胰岛细胞胞质中均呈阳性免疫反应，但是ZnT3的免疫染色较弱。
　　 (5) ZnTs蛋白在睾丸中的分布
　　 所有的ZnTs均表达在睾丸间质细胞中的细胞质，ZnT7也高表达在曲细精管中的精母细胞和精子细胞。
　　 (6) ZnTs蛋白在卵巢中的分布
　　 除了ZnT10，其他ZnT1-5，ZnT7和ZnT8高表达在不同时期卵泡细胞中的颗粒细胞，所有的ZnTs在卵巢黄体中均有强烈的免疫阳性染色反应。
　　 3、zinc在小鼠具有内分泌功能的器官（垂体，肾上腺，甲状腺，胰腺，睾丸和卵巢）中的表达
　　 AMG实验表明在所检测的内分泌细胞的细胞质中均有棕褐色的AMG阳性产物，表明zinc分布在腺垂体细胞，肾上腺皮质细胞，甲状腺滤泡上皮细胞和滤泡旁细胞，胰岛细胞，睾丸间质细胞，曲细精管，卵巢的卵泡颗粒细胞和黄体。二、锌转运体ZnT8参与睾酮分泌的分子机制研究
　　 1、免疫荧光双标实验证实ZnT8蛋白和StAR蛋白在小鼠和人的睾丸间质细胞中共定位。
　　 ZnT8蛋白和StAR蛋白在小鼠和人的睾丸间质细胞中共定位。
　　 2、ZnT8参与hCG诱导的小鼠睾丸间质细胞睾酮生成。
　　 hCG处理乳鼠后，乳鼠血清睾酮浓度升高，睾丸间质细胞锌离子聚集增多，ZnT8蛋白表达水平增多，同时刺激了StAR蛋白的产生。
　　 3、ZnT8介导小鼠睾丸间质细胞瘤细胞（MLTC-1）的锌离子转运
　　 小鼠睾丸间质细胞瘤细胞(MLTC-1)给予高锌、低锌、hZnT8过表达质粒转染和mZnT8 siRNA干扰处理后，观察到高锌组和ZnT8过表达质粒转染组细胞所分泌的孕酮水平升高，低锌组和mZnT8 siRNA干扰组孕酮水平降低，并且这种变化与hCG处理时间呈正比。同时，TSQ荧光染色实验显示hCG处理组，高锌组和ZnT8过表达质粒转染组使MLTC-1细胞中锌离子聚集增多，而低锌组和mZnT8 siRNA干扰组使锌聚集减少。
　　 4、证实ZnT8介导睾酮的生成是通过快速通路还是慢性通路。
　　 小鼠睾丸间质细胞瘤细胞（MLTC-1）给予高锌、低锌、hZnT8过表达质粒转染和mZnT8 siRNA干扰处理后，Western blot结果显示快速通路中P-StAR蛋白在高锌组和ZnT8过表达质粒转染组表达升高，总StAR蛋白在各组间没有变化;慢性通路中总StAR，3β-HSD和P450scc均在低锌组表达降低，这说明ZnT8介导睾酮的生成是通过快速通路。
　　 5、不同处理因素对MLTC-1细胞中cAMP-PKA途径和P-ERK1/2表达水平的影响。
　　 不同处理因素组对MLTC-1细胞的cAMP和PKA水平引起变化，但是没有统计学意义;Western blot结果显示P-ERK1/2蛋白在高锌组和ZnT8过表达质粒转染组表达升高，低锌组和mZnT8 siRNA干扰组P-ERK1/2蛋白水平降低，同时在不同处理因素后应用ERK抑制剂PD98059，孕酮水平的变化被PD98059所抑制，说明ZnT8在快速通路中通过激活ERK的级联反应进行调节StAR的磷酸化参与睾酮合成的分子机制。
　　 结论:
　　 1、在具有内分泌功能的器官（垂体，肾上腺，甲状腺，胰腺，睾丸和卵巢）中
　　 (1) ZnT1-10 mRNA均有表达，但是表达含量不同，ZnT10 mRNA在胰腺中没有表达。
　　 (2) ZnT1-5，ZnT7和ZnT8蛋白也均有表达，含量及组织分布不同，ZnT10蛋白表达在肾上腺，睾丸和黄体。
　　 (3)zinc分布在上述器官，含量多少以及分布方式不同。
　　 2、ZnT8蛋白和StAR蛋白在睾丸间质细胞中共定位，ZnT8参与hCG诱导的小鼠睾丸间质细胞睾酮生成。
　　 3、ZnT8促进hCG处理的MLTC-1细胞内的锌聚集。
　　 4、ZnT8通过在快速通路中，激活ERK的级联反应进行调节StAR的磷酸化进而参与睾酮合成的分子机制。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 锌和锌转运体ZnTs在小鼠内分泌细胞中的表达

前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

结论

论文二 锌转运体ZnT8参与睾酮合成的分子机制研究

前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

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