缺氧诱导因子1-α在大鼠原代心肌细胞缺氧-复氧中的表达及其凋亡作用的研究

摘要

目的：
　　 缺氧/复氧损伤在心肌细胞中是一个极为复杂的过程，现已证明缺氧后复氧可以导致细胞的死亡，细胞死亡既可以由坏死引起又可以是凋亡导致的。坏死是一个破坏性的不可控制的过程，而凋亡是一个高度调控的细胞自杀过程。在心肌细胞缺氧/复氧损伤中，凋亡是引起细胞死亡的一个非常重要的机制，这个机制也是非常复杂的，缺氧诱导转录因子(HIF)在缺氧过程中可以调控一系列基因的表达，高达200种，这些基因能够调节细胞对缺氧或者缺血应激时的反应。
　　 HIF是以异源二聚体的形式存在，由α和β亚单位组成。HIF-1α可以调节细胞的生存与死亡，其可以通过调节血红素加氧酶-1、一氧化氮合酶、环氧化酶-2和血管内皮生长因子等进而促进细胞在缺血再灌注中的生存。同时，HIF-1α也可以激活促死亡调节基因，如Bcl-2蛋白家族的促凋亡蛋白Bnip3、BMF与死亡配体FasL。Bnip3是一种主要存在于线粒体的只含有BH3区域的蛋白，过量表达的Bnip3可以激活Bax/Bak，进而引起线粒体通透性转换孔的开放，最后导致细胞死亡。Bnip3在缺血再灌注时线粒体的功能失调起着至关重要的作用。然而，HIF-1α在不同类型细胞及不同环境中的调节凋亡的作用仍然存在着争议。
　　 本实验主要研究在大鼠原代心肌细胞缺氧/复氧过程中HIF-1α的作用并进一步探讨其主要机制。我们将大鼠原代心肌细胞分别给予正常氧、缺氧5小时、缺氧5小时复氧2小时、缺氧5小时复氧6小时及缺氧5小时复氧12小时来观察HIF-1α的表达情况及凋亡程度。采用小RNA干扰技术来抑制HIF-1α的表达并观察HIF-1α对凋亡的影响。
　　 方法：
　　 一、大鼠原代心肌细胞的培养
　　 1～2d龄SD乳鼠，雌雄不限，将乳鼠用75％的酒精进行消毒，取出心脏，放入不含有钙镁离子的PBS中，用滴管冲洗心脏，剥离心房及其主动脉，弃去PBS液，用剪刀将心脏剪成1mm3的组织块，放入约7.5毫升的0.2％的Ⅱ型胶原酶，共消化4次，每次10-15分钟。被消化下来的心肌细胞，放入离心机中，以300g离心并将获得的细胞种植在25cm2的培养瓶中，放入37℃，5％CO2的培养箱中培养60分钟。采取差速贴壁法纯化心肌细胞，将未贴壁生长的心肌细胞收集并种植在6或24孔板中继续培养。心肌细胞是用含有10％的胎牛血清的DMEM培养基培养。在培养的前48小时在培养基中加入100mmol/LbrdU来抑制非心肌细胞的增殖。采用这种方法培养的原代心肌细胞可以用抗β-肌球蛋白重链单克隆抗体通过免疫荧光的方法来检测，心肌细胞纯度可达90-95％。心肌细胞培养48小时后换用含有10％的胎牛血清、不含BrdU的DMEM培养基培养，所有的实验及检测都在细胞培养48小时后进行。
　　 二、原代心肌细胞缺氧/复氧损伤
　　 为了模仿缺氧环境，心肌细胞在正常培养48小时后将培养基换成配好的Tyrode's溶液(mmol/L: NaCl136.9,KCl2.68, Na2HPO4·12 H2O8.1,KH2PO41.47,CaCl20.9，MgCl2·6 H2O0.49; pH7.2)，然后将细胞转移到5％CO2、95％ N2缺氧培养箱中培养5小时。将缺氧培养5小时的细胞的培养基再次换成含有10％的胎牛血清的DMEM的培养基，放到37℃，5％CO2的培养箱中分别培养2、6与12小时。对照空白组的细胞始终培养在21％O2，5％CO2的培养箱中培养。最后将细胞分别收集进行下一步实验。
　　 三、HIF-1α的siRNA转染
　　 心肌细胞被种植在六孔板中，培养2天后细胞融合率达到约70-80％。分别将干扰HIF-1α的siRNA（100mmol/L）与没有干扰作用作为阴性对照的siRNA(100mmol/L)转染到心肌细胞中，使用Lipofectamine2000转染试剂严格按照生产商提供的步骤进行转染。细胞分成3组:非转染组、阴性对照siRNA组与siRNA转染组。非转染组细胞是没有被转染siRNA的心肌细胞，阴性对照siRNA组细胞是转染无干扰作用的siRNA，siRNA组细胞是转染具有干扰作用的siRNA。每组细胞都将给予正常氧，缺氧5小时以及缺氧5小时复氧6小时的处理。最后将细胞分别收集备用于以后的实验。
　　 四、总RNA的提取及实时定量PCR反应
　　 使用Qiagen Rneasy试剂按照说明书，提取已收集的心肌细胞的总RNA。经过分光度计检测，OD260/280≥1.8以及无明显降解的RNA样本，用于Real-Time PCR。使用TaKaRa SYBR PrimeScript RT PCR Two-Step试剂盒，按照说明书进行Real-Time PCR检测，应用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。用体内稳定表达的磷酸甘油醛脱氢酶作为内参来评估mRNA的提取及反转录反应。
　　 五、Western Blot分析
　　 用Western Blot的方法对细胞裂解液进行蛋白的半定量分析。用抗HIF-1α，Bnip3，β-actin(Santa Cruz)以及激活型的caspase-3抗体，用含有5％的脱脂奶粉的TBST溶液以1∶1000的浓度稀释，4℃孵育过夜。二抗以1∶2000的浓度稀释，使用加强化学发光系统按照说明书操作就可以使蛋白显影了。
　　 六、流式细胞仪凋亡分析
　　 采用Annexin V-FITC双染凋亡检测试剂盒(KeyGEN)来分析各组心肌细胞中的凋亡情况，按照说明书进行实验。简单的说，每组心肌细胞收集约10，000个，加入双染试剂后用流式细胞仪进行检测。
　　 结果：
　　 一、缺氧/再给氧引起HIF-1α的表达增加以及心肌细胞的凋亡
　　 为了检测在缺氧/复氧的过程中，HIF-1α的表达以及心肌细胞凋亡的情况，将心肌细胞分成5组:正常氧组，缺氧5小时，缺氧5小时复氧2小时，缺氧5小时复氧6小时和缺氧5小时复氧12小时。我们的结果显示缺氧5小时组HIF-1α的表达以及心肌细胞凋亡率与正常组相比显著增加，同时我们发现缺氧5小时复氧2小时组HIF-1α的表达以及心肌细胞凋亡率与缺氧5小时组相比显著增加，缺氧5小时复氧6小时组的HIF-1α的表达以及心肌细胞凋亡率是所有时间点中最高的。这些数据给了我们一些提示，在缺氧/复氧损伤中HIF-1α在心肌细胞凋亡的过程中可能起着重要的作用。
　　 二、Bnip3增加的变化趋势与HIF-1α的变化相同
　　 为了检测Bnip3的变化，细胞仍分为5组:正常氧组，缺氧5小时，缺氧5小时复氧2小时，缺氧5小时复氧6小时和缺氧5小时复氧12小时。缺氧再给氧组Bnip3的mRNA及蛋白表达与单独缺氧组相比显著增多，在缺氧5小时复氧6小时组Bnip3的mRNA及蛋白表达量达到最高值，这种变化与HIF-1α的变化相似。综合上述结果，我们提出了在缺氧复氧引起的心肌细胞凋亡的过程中HIF-1α与Bnip3存在着一定的联系。
　　 三、用siRNA抑制HIF-1α的表达可以减轻缺氧5小时复氧6小时心肌细胞的凋亡
　　 如果HIF-1α在缺氧5小时复氧6小时能够引起心肌细胞凋亡，那么使用siRNA来抑制HIF-1α的表达有可能减少心肌细胞的凋亡。结果显示siRNA干扰组缺氧5小时复氧6小时HIF-1α的mRNA和蛋白的表达与阴性对照和非转染组相比显著降低，与非干扰组正常氧相比仍然增加。HIF-1α的表达可以被siRNA抑制，siRNA干扰组在缺氧5小时复氧6小时时凋亡的心肌细胞与阴性对照组和非转染组相比显著减少。然而，siRNA干扰组在缺氧5小时复氧6小时时凋亡的心肌细胞数仍然多于非干扰组正常氧时凋亡的心肌细胞数。这些结果显示了siRNA在缺氧5小时复氧6小时能够减少凋亡的心肌细胞，在缺氧及复氧时siRNA可以干扰HIF-1α的表达。
　　 四、siRNA抑制HIF-1α的表达可以减少caspase-3的表达
　　 心肌细胞的凋亡可以由凋亡的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）触发。在非转染组中缺氧5小时复氧6小时caspase-3的mRNA表达量与缺氧5小时相比明显增多。被切割的caspase-3是caspase-3的激活形式，在非转染组中缺氧5小时复氧6小时激活的caspase-3蛋白的含量与缺氧5小时相比明显增多。然而，用siRNA抑制HIF-1α的表达，在缺氧5小时复氧6小时时caspase-3的表达与非转染组和阴性对照转染组相比明显减少。
　　 五、siRNA抑制HIF-1α的表达可以减少Bnip3的表达
　　 我们发现siRNA抑制了HIF-1α的表达可以显著缺氧5小时复氧6小时Bnip3的表达，与非转染组及阴性对照组相比存在着显著的差异。综合以上的结果，我们可以得出这样的结论，通过siRNA来抑制HIF-1α的表达可以保护缺氧5小时复氧6小时的心肌细胞使其凋亡减轻，HIF-1α在缺氧复氧时所引起的细胞凋亡与Bnip3的激活有关。
　　 结论：
　　 本次实验我们通过培养的原代心肌细胞来观察到缺氧后不同复氧时间细胞中的HIF-1α的mRNA及蛋白的表达增加，凋亡的心肌细胞数增多。这就说明了细胞在受到缺氧复氧损伤时表达增多的HIF-1α可以诱导细胞的凋亡。我们采用siRNA干扰的技术将沉默HIF-1α的siRNA转染到心肌细胞中，结果证实了HIF-1α的表达被抑制了可以减少凋亡的心肌细胞，足以看出HIF-1α在细胞缺氧/复氧损伤中起到了重要的作用。
　　 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）是众所周知的凋亡执行酶，我们的实验证实了在缺氧/复氧损伤中HIF-1α引起的凋亡是最终激活了凋亡执行酶caspase-3。同时，实验结果证实了Bnip3在缺氧复氧时的增多趋势与HIF-1α的变化一致，而且在缺氧/复氧时抑制了HIF-1α的表达能够减少Bnip3的表达。据此，我们得出结论1、缺氧/复氧能触发原代心肌细胞凋亡，凋亡的发生主要通过激活了HIF-1α、Bnip3和caspase-3;2、在细胞缺氧/复氧时，HIF-1α介导的凋亡是由于其激活了下游的促凋亡蛋白Bnip3而产生的。HIF-1α的这些功能使它成为一个心肌梗死后有效限制心肌损伤的新靶点，为临床提供一个新的治疗策略和方向。

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