金属蛋白酶组织抑制剂对兔动脉粥样硬化血管平滑肌细胞及巨噬细胞的功能影响研究

摘要

心脑血管疾病现已成为人类生命健康的头号杀手，研究发现动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是动脉瘤、心肌梗塞等心脑血管疾病最主要的病理基础。因此，AS的早期预防和治疗对于提高人们的生活质量有着重要的意义。
　　基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)是一类依赖于锌、钙离子的内肽酶，其在生理条件下几乎能降解所有细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分。在血管内皮损伤及炎性细胞浸润、血管重构、粥样斑块形成及发展过程中，均起着重要作用。金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metallo-proteinases，TIMPs)是MMPs的天然拮抗剂，它通过对MMPs的抑制在正常ECM改建和各种病理过程中发挥着重要作用。大量研究证明动脉粥样硬化及动脉瘤病变局部MMPs和TIMPs比例失衡，MMPs水平增高及TIMPs水平降低。
　　基于以上认识，我们设想以覆膜血管内支架为载体，实现主动脉壁局部功能基因转染，提高主动脉壁局部TIMP水平，抑制MMPs的蛋白水解作用，从而改善血管结构。在主动脉壁局部功能基因转染前，我们先评价TIMPs对参与动脉粥样硬化及动脉瘤病变关系最密切的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)及巨噬细胞的功能影响，以便为进一步选择目的治疗基因实现主动脉局部基因转染并促进主动脉病变修复提供实验基础。
　　本研究分为三部分:
　　第一部分:胰弹性蛋白酶浸润加高脂饮食法建立兔腹主动脉粥样硬化模型。
　　目的:评价在高脂饲料喂养基础上采用胰弹性蛋白酶(pancreatic elastase，PE)浸润法制备兔主动脉粥样硬化模型的可行性。
　　方法:分别采用高脂饲料喂养+PE浸润法及高脂饲料喂养+球囊损伤法制备兔AS模型，设立正常饮食组作为对照。通过生化指标、影像学检查、病理形态学及免疫组织化学检测评价高脂饲料喂养+PE浸润法造模结果，并与正常饮食组及高脂饲料喂养+球囊损伤法造模结果相比较。
　　结果:血管造影检查，PE浸润局部管腔较正常血管略扩张，形态不规整，有进一步缩小趋势。病理形态学检测，PE浸润组动脉内膜增厚，伴有脂质沉积，可见斑块形成。半定量分析PE组及球囊损伤组弹性蛋白成分明显低于正常对照组，两实验组间比较无统计学差异。免疫组织化学检测，PE浸润组及球囊损伤组MMP-9，MMP-2及巨噬细胞免疫染色与对照组相比均显示出较高水平的蛋白表达，对照组没有MMP-2、MMP-9及巨噬细胞表达，两实验组间没有明显差异。
　　结论:高脂饲料喂养加PE浸润法处理后，局部血管病理形态学及免疫组织化学结果都与AS改变相符合，证实了PE浸润动脉外周后损伤内膜的有效性及制备AS模型的可行性。
　　第二部分:TIMPs对兔动脉粥样硬化血管壁平滑肌细胞迁移、凋亡、增殖的功能影响及机制探讨。
　　目的:评价不同浓度TIMP-1，2，3对兔动脉粥样硬化血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)体外迁移、凋亡、增殖功能的影响及机制探讨。
　　方法:采用transwell小室法进行VSMC的迁移实验，通过比较迁移细胞数量评价TIMPs对迁移能力的影响。通过BrdU荧光染色，评价TIMPs对VSMC增殖能力的影响。采用流式细胞术检测VSMC凋亡。
　　结果:迁移实验:不同浓度TIMP-1，2，3组镜下计数迁移细胞数与对照组相比均有减少。增殖实验:3ng/ml浓度TIMP-1，2，3镜下计数核染细胞数与对照组相比无差别，其余各浓度实验组核染细胞数与对照组相比均有减少。凋亡实验:各浓度TIMP-1组VSMC凋亡率与对照组相比无统计学差异，10ng/ml-100ng/ml浓度TIMP-2，3组VSMC早期凋亡率与对照组相比有降低。
　　结论:浓度3ng/ml-100ng/ml TIMP-1，2，3对VSMC体外迁移有抑制作用;浓度10ng/ml-100ng/ml TIMP-1，2，3对VSMC体外增殖有抑制作用，浓度3ng/ml TIMP-1，2，3对VSMC体外增殖无作用;TIMP-1对VSMC早期凋亡无影响，10ng/ml-100ng/ml浓度TIMP-2，3对VSMC早期凋亡有抑制作用。
　　第三部分:TIMPs对兔腹腔巨噬细胞体外迁移、凋亡、MMP-9合成功能的影响及机制研究。
　　目的:评价不同浓度TIMP-1，2，3对兔腹腔巨噬细胞体外迁移、凋亡及MMP-9合成功能的影响。
　　方法:采用transwell小室法进行巨噬细胞的迁移实验，流式细胞术检测VSMC凋亡，Western blotting法检测巨噬细胞合成MMP-9含量变化。
　　结果:浓度10ng/ml-100ng/ml TIMP-2，3组迁移细胞数与对照组相比有明显减少，各浓度TIMP-1实验组及浓度3ng/ml TIMP-2，3实验组迁移细胞数与对照组相比没有统计学差异;浓度10ng/ml-100ng/ml TIMP-2，3组巨噬细胞早期凋亡率与对照组相比有降低，各浓度TIMP-1实验组巨噬细胞凋亡率与对照组相比无统计学差异;浓度10 ng/ml-100ng/ml TIMP-2，3组MMP-9条带灰度值均低于对照组。
　　结论:浓度10ng/ml-100ng/ml TIMP-2，3对兔腹腔巨噬细胞体外迁移有抑制作用。TIMP-1及低浓度（3ng/ml）TIMP-2，3对巨噬细胞迁移无影响;浓度10ng/ml-100ng/ml TIMP-2，3对兔腹腔巨噬细胞凋亡有抑制作用，TIMP-1对巨噬细胞凋亡无影响;浓度10ng/ml-100ng/ml TIMP-2，3对兔腹腔巨噬细胞合成MMP-9有抑制作用。

目录

声明

摘要

英文缩略语一

论文一 胰弹性蛋白酶浸润加高脂饮食法建立兔腹主动脉粥样硬化模型

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 TIMPs对兔动脉粥样硬化血管平滑肌细胞迁移、凋亡、增殖的功能影响及机制探讨

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 TIMPs对兔腹腔巨噬细胞体外迁移、凋亡、MMP-9合成功能的影响及机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 主动脉瘤发病机制的相关研究及治疗现状

在学期间科研成绩

致谢

个人简历