14-3-3蛋白在胚胎脊髓发育过程中表达规律及其在先天性脊柱裂发生过程中作用机制研究

摘要

先天性脊柱裂(spina bifida，SB)是一种常见的严重的小儿先天畸形，其人群发病率约为1‰-2‰。很多患儿接受了传统的生后修补术后，出现脑积水、下肢功能障碍、性功能障碍和尿便失禁等严重的术后并发症，而将手术修补时间提前至出生前的胎儿宫内修补术在临床的应用，也未能减少患儿术后并发症的发生，因此，我们考虑先天性脊柱裂治疗效果不佳可能与其本身存在的原发性脊髓发育不良有关。先天性脊柱裂脊髓发育不良既可直接来源于神经管闭合的原发缺陷，又可继发于子宫内羊水的损伤。课题组前期研究已经确认了脊柱裂胎鼠支配肛提肌的运动和感觉神经元发育缺陷。为了探索先天性脊柱裂脊髓组织神经损伤的机制，课题组利用二维电泳对E17天正常胎鼠和脊柱裂胎鼠脊髓组织进行蛋白质组学研究，结果发现了13种差异表达蛋白，其中包括四种14-3-3蛋白亚型(14-3-3β、14-3-3θ、14-3-3ε和14-3-3ζ)。
　　14-3-3蛋白是一组分子量约为30KDa的酸性蛋白家族，该家族蛋白与众多的配体结合，通过多种机制调控靶蛋白，直接参与细胞内信号的传导，从而在细胞凋亡、细胞有丝分裂、细胞周期控制等重要的细胞事件中发挥至关重要的作用。然而，二维电泳筛查出的四种14-3-3差异表达蛋白(14-3-3ε、14-3-3ζ、14-3-3β、14-3-3θ)在正常和脊柱裂胎鼠脊髓组织中的表达规律还未见报道。在这四种14-3-3蛋白中，14-3-3ζ与细胞凋亡的关系最为密切。14-3-3ζ抑制细胞凋亡的发生已经在肿瘤、神经变性病等疾病中得到确认。近期，越来越多的研究已经开始关注14-3-3ζ是如何被调控的以及14-3-3ζ是如何抑制凋亡发生的。microRNAs(miRNAs)对14-3-3ζ的调控在文献上已有报道。据报道，乳腺癌细胞过度表达的14-3-3ζ蛋白增加了p53蛋白的降解，从而抑制细胞凋亡的发生;相反，通过siRNA下调14-3-3ζ的表达可显示增高的p53蛋白的表达，从而促进细胞凋亡的发生。
　　因此，本研究应用维甲酸在大鼠神经管闭合的关键期胚胎10天(embryonic10，E10)给药，建立脊柱裂大鼠模型。以胎鼠的脊髓组织为主要研究对象，应用实时逆转录聚合酶链反应(Real-time reverse-transcription PCR，qRT-PCR)方法、Western-blot方法和免疫组化方法，分别在基因水平和蛋白水平观察不同胚胎发育期正常对照组和脊柱裂组脊髓中14-3-3β、14-3-3θ、14-3-3ε和14-3-3ζ的表达情况，以探讨四种14-3-3蛋白亚型在不同胚胎发育期的表达规律;在此基础上，应用荧光双染技术同时检测14-3-3ζ蛋白和TUNEL，qRT-PCR检测14-3-3ζ蛋白的上游分子miR-7、miR-375和miR-451，Western-blot方法检测14-3-3ζ蛋白下游分子p53的表达，以探讨14-3-3ζ蛋白在先天性脊柱裂发生及神经损伤中的作用，为阐明脊柱裂的发病机制和寻找新的治疗靶点提供理论依据。
　　方法:
　　1、动物模型建立与标本收集
　　成熟未孕Wistar大鼠，雄雌比例5∶1午夜合笼，晨8-9时阴道涂片，显微镜下见到精子记为E0。维甲酸致畸组在E10经胃管注入维甲酸（剂量150mg/ kg体重）;对照组给予等体积的橄榄油。分别于E11、E12、E13、E15、E17、E19剖宫取出胎鼠，解剖显微镜下辨认畸形，取出胎鼠脊髓，-80℃保存或4％多聚甲醛固定。
　　2、qRT-PCR检测不同胚胎发育期脊髓组织14-3-3β、14-3-3θ、14-3-3ε、14-3-3ζ、miR-7、miR-375和miR-451基因的表达
　　(1)提取总RNA:应用美国Ambion公司生产的mirVanaTM miRNA分离试剂盒提取总RNA，具体操作步骤严格按照操作说明进行。提取的总RNA用于14-3-3β、14-3-3θ、14-3-3ε和14-3-3ζ基因，以及miR-7、 miR-375、miR-451基因水平的检测。
　　(2)反转录:使用15μl反应体系(total RNA5μ1，10×RT buffer1.5μl，5×RTprimer3μl,100mM dNTPs0.15μl,RNase Inhibitor(20 U/μL)0.19μl,Nuclease-freewater4.16μl，MultiScribeTM Reverse Transcriptase(50 U/μL)1μ1），反转录条件16℃30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟然后置于4℃中。
　　(3) real-time PCR反应:应用美国Applied Biosystems公司生产的7500快速实时定量PCR系统进行检测。首先，调整cDNA浓度为500 ng/ul，14-3-3β、14-3-3θ、14-3-3ε和14-3-3ζ基因采用10ul反应体系(SYBR(@) Premix Ex TaqTM(2×)，5μl;PCR primer(5 uM)，1μl; H2O，3μl;模板cDNA，1μl），反应条件为:预变性95℃30秒;变性95℃5秒，45个循环;退火60℃20秒(14-3-3β、14-3-3ε、14-3-3ζ和β-actin)或退火63℃20秒(14-3-3θ)。miR-7、miR-375和miR-451基因采用20ul反应体系(cDNA模板1.3μl，TaqMan2× Universal PCR Master Mix10μl，Nuclease-free water7.7μl，20× TaqMan MicroRNA Assay1μl)，反应过程如下:UTPase失活50℃2 min，预变性95℃10 min，95℃15 sec变性45个循环，退火60℃60 sec.。每个样本行3个平行孔重复实验，LightCycler软件分析目的基因的相对表达量，fold induction=2-△△Ct，△△Ct=（实验组目的基因Ct—内参Ct）—（对照组目的基因Ct—内参Ct）。
　　3、Western blot方法验证差异蛋白质在脊髓组织中的表达
　　取对照组、给药无畸组和脊柱裂组脊髓组织各8例，提取蛋白。取蛋白样品溶液上样，恒流电泳15mA/胶，2小时。将电泳后的胶按照8层滤纸—PDVF膜—凝胶—8层滤纸顺序制作转膜三明治，恒流1mA/cm2，1小时转膜。将PVDF膜常温封闭2小时，加一抗，4℃过夜。加二抗，室温2小时。ECL显示条带，捕获图象并分析目标带光密度值。
　　4、免疫组化
　　取4％多聚甲醛固定的脊髓标本各3例，进行石蜡切片。石蜡切片脱蜡、复水;3％H2O2，室温20min; L.A.B.抗原修复，60℃，20min;10％血清封闭，室温30min;一抗（兔抗大鼠14-3-3ε、14-3-3ζ，1∶100）4℃，过夜;生物素化山羊抗兔二抗IgG，室温15min;滴加SABC复合物，室温20min; DAB显色;脱水、封片。
　　5、荧光双染方法检测神经管14-3-3ζ蛋白和细胞凋亡
　　大鼠E13天尾骶部神经管横向切片进行TUNEL和14-3-3ζ的荧光双染。具体操作步骤简言之，脱蜡并水化后的切片浸泡于含0.1％Triton x-100的蛋白激酶K的PBS缓冲液，37℃10分钟;再置于0℃含有0.1％Triton x-100浓度为10nM的柠檬酸中2分钟;然后切片用含有10％FBS、0.1％ Triton x-100的PBS封闭，再加1∶100稀释的14-3-3ζ抗体4℃过夜。清洗切片，加TUNEL反应混合液和TRITC抗兔IgG抗体37℃1.5小时，避光。照相前DAPI复染5分钟。共焦显微镜用于图片拍摄。
　　6、统计学处理
　　用SPSS12.0统计分析软件对实验数据进行统计分析，实验组与对照组间比较采用t检验，单向方差分析用于多组间的比较分析，p＜0.05认为有统计学差异。
　　结果:
　　1、全反式维甲酸诱导的先天性脊柱裂大鼠模型
　　成功制作先天性脊柱裂的Wistar大鼠动物模型，共剖检孕鼠(E11、E12、E13、E15、E17、E19)80只。维甲酸致畸孕鼠52只，共获得胎鼠265只，其中脊柱裂胎鼠125只，无畸形胎鼠140只（致畸率47.2％）;对照组孕鼠28只，共获得正常胎鼠165只。
　　2、qRT-PCR检测14-3-3β、14-3-3θ、14-3-3ε和14-3-3ζmRNA表达结果
　　14-3-3β、14-3-3θ、14-3-3εmRNA在不同胚胎发育期(E11、E12、E13、E15、E17、E19)，正常胎鼠和脊柱裂胎鼠的神经管/脊髓组织中均有表达，其中14-3-3β、14-3-3θmRNA在两组胎鼠表达无显著性差异，p＞0.05。14-3-3εmRNA水平，脊柱裂胎鼠在E12～E17天明显低于正常对照组胎鼠，有统计学意义，p＜0.01;14-3-3ζmRNA水平，脊柱裂胎鼠在E12～E15天明显低于正常对照组胎鼠，有统计学意义，p＜0.01。为了探讨14-3-3εmRNA水平的降低是否来源于维甲酸药物本身，本实验加入了给药无畸形组，结果显示给药无畸形组胎鼠14-3-3ε、14-3-3ζmRNA表达趋势与正常对照组胎鼠相似，无显著差异，p＞0.05。
　　3、WesteRN blot检测14-3-3β、14-3-3θ、14-3-3ε和14-3-3ζ蛋白表达结果
　　14-3-3β、14-3-3θ、14-3-3ε和14-3-3ζ蛋白在不同胚胎发育期(E11、E12、E13、E15、E17、E19)，正常胎鼠和脊柱裂胎鼠的神经管/脊髓组织中均丰富表达，其中14-3-3β、14-3-3θ在两组胎鼠表达无显著性差异，p＞0.05。14-3-3ε蛋白，脊柱裂胎鼠在E12～E17天明显低于正常对照组胎鼠，E12、E17天与正常对照组胎鼠相比，p＜0.05; E13、E15天与正常对照组胎鼠相比，p＜0.01。4-3-3ζ蛋白，脊柱裂胎鼠在E12～E15天明显低于正常对照组胎鼠，E12天与正常对照组胎鼠相比，p＜0.05; E13、E15天与正常对照组胎鼠相比，p＜0.01。
　　4、免疫组化14-3-3ε和14-3-3ζ蛋白的表达结果
　　脊柱裂胎鼠与正常胎鼠相比，降低的14-3-3ε蛋白主要集中在神经管的腹侧，而14-3-3ζ蛋白主要集中在神经管的背侧和腹侧。
　　5、qRT-PCR检测miR-7、miR-375和miR-451的表达结果
　　脊柱裂胎鼠miR-375的表达在E13天明显高于正常胎鼠(1.328±0.218 vs.1.005±0.098，p＜0.01)，而miR-451的表达在E13、E15天均明显高于正常胎鼠(E13:1.163±0.189 vs.0.652±0.133,E15:1.012±0.241 vs.0.617±0.218, p＜0.01)。
　　6、脊柱裂胎鼠神经管14-3-3ζ的低表达区域细胞凋亡明显增加
　　与正常胎鼠相比，脊柱裂胎鼠神经管14-3-3ζ低表达区域细胞凋亡明显增加，表明14-3-3ζ低表达与凋亡增加密切相关。
　　7、western blot检测P53蛋白的表达结果
　　与正常胎鼠相比，脊柱裂组胎鼠p53蛋白在E13、E15天明显升高(E13:0.485±0.106 vs.0.295±0.109，E15:0.450±0.093 vs.0.280±0.088，p＜0.05)，而在E12天改变无统计学意义。
　　结论:
　　1、14-3-3β、14-3-3θ不参与先天性脊柱裂的发病和神经损伤的发生。
　　2、先天性脊柱裂胎鼠14-3-3ε的表达在E12-E17天明显低于正常胎鼠，提示其表达的减少参与脊柱裂胎鼠神经损伤的发生。
　　3、先天性脊柱裂胎鼠14-3-3ζ的表达在E12-E15天明显低于正常胎鼠，其表达的减少是通过促进细胞凋亡导致脊髓神经损伤。
　　4、脊柱裂胎鼠14-3-3ζ表达的下调可能与miR-375、miR-451的上调有关，p53蛋白的上调可能是由于14-3-3ζ表达的下调所导致的，其表达水平的上调进一步促进了细胞凋亡的发生。

目录

声明

摘要

英文缩略词

论文一 14-3-3蛋白在先天性脊柱裂不同胚胎发育期脊髓组织中表达规律的研究

前言

材料与方法

实验结果

论文二 14-3-3ζ毛参与先天性脊柱裂细胞凋亡分子机制的初步探讨

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 14-3-3蛋白在神经系统疾病中的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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