缺氧诱导因子-1在肺非小细胞癌胸水中的表达及其与血管样管型结构形成的关系

摘要

目的:
　　 探讨缺氧诱导因子-1和肿瘤细胞形成的血管样管型结构在非小细胞肺癌胸水中的表达及其与血管样管型结构形成的关系，评估它在非小细胞肺癌发生发展过程中的作用。
　　 材料与方法:
　　 1、材料
　　 收集2011年1月至2012年12月中国医科大学附属第一医院门诊及病房胸腔积液，优选以肿瘤细胞为主、炎性细胞较少（肿瘤细胞约占整张切片的95％以上）未接受过治疗的100例NSCLC胸腔积液作为研究对象（经临床表现、CT、MR等临床资料及41.5％的患者进一步做肺部肿瘤进行肺穿后进组织病理学诊断为NSCLC，另外50例良性胸腔积液标本作为对照。这150人中男性为79人，女性为71人，年龄从30岁至82岁，平均年龄均为61岁。
　　 2、液基细胞薄层检测技术(HOLOGIC TCT)
　　 收集新鲜胸水20ml左右，室温下800r/min离心5分钟，弃去上清，取沉淀底层细胞，加入清洗液后再次离心。取沉淀与保存液混合后机器Thinprep2000自动制片。
　　 3、缺氧对照处理
　　 经HOLOGIC TCT诊断为非小细胞肺癌的100例胸水标本分为两组，实验组不做处理，对照组置于CO2培养箱里进行缺氧处理，并进行Western Blot以及包埋切片、免疫细胞化学染色和实验组定性、定量比较H IF-1α和HIF-1β的表达情况。
　　 4、特殊染色
　　 PAS染色试剂盒（产品编号101103002），六胺银套组染色试剂盒（产品编号101103005），爱先蓝染色试剂盒（产品编号101103009）均购自于长春赛默瑞特生物技术有限公司。
　　 5、免疫细胞化学染色
　　 HIF-1α(SC-53546)、CD34(SC-65261)、TTF-1(SC-53136)、CK5&6(SC-60041)、VEGF(SC-57496)均购自美国Santa Cruz公司，HIF-1β(ab54786)购自英国abcam公司。采用链霉菌抗生物素-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法，PBS缓冲液代替第一抗体作为空白对照，DAB显色，苏木素复染。常规脱水透明，中性树胶封片。
　　 6、免疫荧光染色方法
　　 采用免疫荧光双染法法检测HIF-1α和HIF-1β的表达定位。首先将选出的切片放于69℃烤片机上2小时，后于二甲苯中脱蜡，酒精脱苯，高温高压法进行抗原修复。加非免疫动物血清37℃封闭30分钟，滴加一抗（1∶100稀释，选择不同二抗的一抗按1∶1比例两两混合），4(″)C孵育过夜;免疫荧光二抗（1∶500稀释，不同种属二抗按1∶1两两混合），37(″)C孵育30分钟。DAPI复染细胞核。50％缓冲甘油封片，荧光显微镜Nikon90i下观察并照相。孵育二抗以后步骤均在避光条件下进行。阴性对照实验:用等量的0.01mol/L PBS代替一抗，其余步骤同前。结果判定:以细胞胞浆中呈现明亮的绿色和红色荧光信号，合成后为黄色的荧光信号定位为阳性。
　　 7、Western Blot蛋白印迹
　　 为了检测血管及淋巴管上皮因子的表达水平，在100例胸腔积液标本（70例NSCLC患者胸腔积液，30例炎性及增生胸腔积液）中检测了HIF-1α和HIF-1β的蛋白水平。总蛋白从胸水细胞中提取，冰上超声处理，4℃静置，孵育50min，4℃离心20min(800r/min)，提取上清，放入-70℃冰箱里保存。使用前，用Brodford法测定蛋白浓度，以每孔80μg蛋白加入10％SDS-PAGE凝胶电泳后，4℃，90V条件下湿电转移仪将蛋白转入0.22μmPVDF膜，5％脱脂奶粉封闭液封闭2h，一抗(1∶100稀释)4℃过夜，后用TTBS洗膜，二抗（1∶1000稀释），X底片曝光，显影，定影后拍照，以β-actin为内参，用凝胶成像及分析系统(BioImaging Systems，美国)分析蛋白各条带的灰度值，每组结果均为相同条件重复3次。Western blotting试验中使用的试剂包括:HIF-1α(SC-53546)购自美国Santa Cruz公司，HIF-1β(ab54786)购自英国abcam公司。
　　 8、非小细胞肺癌患者肺穿后固定包埋，HE染色和免疫组化染色。
　　 9、统计分析
　　 各组资料利用SPSS13.0进行统计分析。p＜0.05有统计学意义。
　　 结果:
　　 NSCLC患者胸腔积液HOLOGIC TCT中发现紧密彩球状、灯泡状或是桑葚状排列的肿瘤细胞，对阳性标本包埋、切片HE染色后可观察到肿瘤细胞组成的血管样管型结构。HIF-1α在NSCLC胸水中阳性表达率为8％，显著低于缺氧对照组的73％，两者之间比较有显著性差异(P＜0.01); HIF-1β在NSCLC胸水中阳性表达率为62％，在缺氧对照组中的阳性表达率为71％，两者之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。NSCLC胸水中HIF-1α表达与VEGF的表达呈正相关性，NSCLC胸水中HIF-1α表达与HIF-1β的表达呈正相关性。(P＜0.05)
　　 结论:
　　 1、NSCLC胸水肿瘤细胞在缺少营养和养分的条件下可以分化为肿瘤细胞血管样管型，为其生存和转移提供条件。
　　 2、胸腔积液中的肿瘤细胞在离体缺氧条件下形成血管样管型结构之后，使肿瘤细胞的缺氧状态得到改善，可能通过负反馈调节抑制H IF-1α的表达。
　　 3、HIF-1α与HIF-1β表达正相关，共同促进了微血管的形成，加速了肿瘤的发展和侵袭。
　　 4、HIF-1和VEGF的表达对肿瘤细胞血管样管型形成起重要作用，联合检测HIF-1、VEGF的表达对了解肿瘤血管形成的机制有一定意义，可以进一步深入研究肿瘤血管形成的分子水平调控机制。

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