β-榄香烯对缺氧诱导的肿瘤细胞增殖活性及HIF-1α和VEGF表达的影响

摘要

背景：肿瘤发生发展过程中的一切活动，如肿瘤血管形成、侵袭、转移、多药耐药等都离不开肿瘤微环境。缺氧是肿瘤微环境的重要特征，其使肿瘤细胞对放疗和某些细胞毒性药物产生抗拒，增加了肿瘤基因不稳定同时也使细胞毒性免疫细胞功能受损。肿瘤血管和微环境异常是肿瘤细胞耐药的重要原因之一。
　　 肿瘤微环境缺氧诱导的一系列效应主要依赖缺氧诱导因子1α(HIF-1α)。HIF-1是一种异源二聚体，由HIF-1α，HIF-1β两个亚基组成，属于螺旋-环-螺旋超家族的转录因子，HIF-1α主要对缺氧发生反应，是唯一的氧调节亚单位，是HIF-1的限速因子。
　　 VEGF是最早发现的作用最强的促肿瘤血管新生因子之一，也是肿瘤血管治疗中的主要靶分子。由于VEGF在血管新生中发挥主导性作用，因此多数研究将VEGF或其受体作为治疗的靶点。
　　 榄香烯(elemene)是我国首先从姜科植物温郁金（温莪术）Curcumazedoaria(Berg) Rosc的根茎中提取的抗癌有效成分，是国家二类非细胞毒性抗肿瘤药物。目前的制剂以β-榄香烯主要成分。大量研究表明，榄香烯对体内外多种肿瘤细胞具有显著的抑制和杀伤作用，榄香烯能通过抑制VEGF和VEGF受体表达来抑制肿瘤血管形成及肿瘤生长和转移。
　　 虽然目前没有关于榄香烯与肿瘤微环境的更直接的研究，但是肿瘤血管的形成及肿瘤多药耐药现象的出现都与肿瘤微环境有关，所以我们推测榄香烯必然在改善肿瘤微环境中发挥重要作用。本实验试图通过检测缺氧效应中的关键因子HIF-1α的表达来观察β-榄香烯对缺氧微环境的作用。检测VEGF的表达探讨在缺氧状态下β-榄香烯对肿瘤血管新生的可能影响。
　　 方法：
　　 一、人肝癌HepG2细胞培养人肝癌HepG2细胞置于含10％FBS的DMEM高糖培养液中，分别在37℃，5％CO2，2％O2,低氧培养箱及37℃，5％CO2，17％O2正常氧培养箱中培养，用0.125％胰酶（含0.02％EDTA）消化，传代。
　　 二、四唑氮蓝还原反应(MTT)检测细胞增殖将HepG2细胞接种于96孔板，培养24小时，加入无血清培养液继续培养12小时，分别加入含有20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，160μg/mlβ-榄香烯的培养液，以不含β-榄香烯的孔为对照组，继续培养24小时。加入MTT溶液，4小时后孔内形成紫色结晶，加入200μ1 DMSO溶液终止反应，振荡混匀，使结晶充分溶解，置于酶标仪上检测光吸收值(OD)，测定波长为490nm。细胞增殖抑制率=（实验组OD值-对照组OD值）/（对照组OD值-空白孔OD值）×100％。
　　 三、Real time RT-PCR检测细胞HIF-1α、VEGF-AmRNA表达分别在常氧及低氧下培养人肝癌HepG2细胞，加入β-榄香烯溶液，使其终浓度分别为0，20μg/ml，40μg/ml，作用于HepG2细胞24小时。收集待测细胞，进行RNA提取，反转录后在荧光定量PCR仪上进行扩增，最后计算mRNA的相对表达量，每个样本设3个复孔。
　　 四、统计学处理实验数据采用SPSS13.0统计分析软件进行单因素方差分析，两因素方差分析，组间比较用LSD，P＜0.05有统计学意义。
　　 结果：
　　 一、低氧下培养人肝癌HepG2细胞的形态观察低氧下培养的HepG2细胞的形态与正常氧浓度下无明显差别。
　　 二、β-榄香烯对低氧诱导的HepG2细胞增殖的影响MTT法检测，不同浓度β-榄香烯对低氧下HepG2细胞的增殖具有抑制作用，呈剂量依赖性，差异有统计学意义。80μg/ml、160μg/mlβ-榄香烯对HepG2细胞直接杀伤作用明显，抑制率接近100％，两组间差异无统计学意义。
　　 三、β-榄香烯对常氧及缺氧诱导的人肝癌HepG2细胞HIF-1α和VEGF-AmRNA表达的影响低氧能够明显诱导HepG2细胞HIF-1α和VEGF-AmRNA的表达，使其表达量明显增加，与常氧组比较，差异有统计学意义。
　　 不论常氧和低氧培养，加入β-榄香烯对HepG2细胞HIF-1α和VEGF-AmRNA的表达均有明显抑制作用，与不加β-榄香烯的对照组比较，差异有统计学意义。并且随β-榄香烯浓度的增加，其HIF-1α和VEGF-AmRNA表达量呈减少趋势。
　　 与常氧组比较，低氧组加入不同浓度β-榄香烯对HepG2细胞HIF-1αmRNA表达的抑制作用更加明显，两种氧条件下HIF-1αmRNA相对表达量的差异有统计学意义;而低氧或常氧状态下，β-榄香烯对HepG2细胞VEGF-A mRNA表达的抑制作用无明显差异。
　　 结论：
　　 1、β-榄香烯对低氧培养人肝癌HepG2细胞的增殖有抑制作用，并呈浓度依赖性。
　　 2、β-榄香烯对常氧及低氧诱导的人肝癌HepG2细胞HIF-1α及VEGF-A mRNA的表达有抑制作用。
　　 3、β-榄香烯对低氧诱导的人肝癌HepG2细胞HIF-1αmRNA表达的抑制作用比常氧诱导时明显。

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