基于IDO1基因沉默的转移性乳腺癌基因免疫治疗及其与DC/NK细胞相互作用关系的研究

摘要

近年来世界各国女性乳腺癌发病率均呈现上升趋势，在中国乳腺癌已成为女性最常见的恶性肿瘤[1,2]。2010年2月《中国乳腺疾病调查报告》显示我国城市中乳腺癌的死亡率增长了38.91％，在美国，乳腺癌是仅次于肺癌的第二位癌症死亡原因，2009年查出女性新发癌症病例739940例，其中乳腺癌排在第一位，占28％[3,4]。近年来随着医疗水平的不断进步，早中期乳腺癌可接受手术、放化疗、内分泌、靶向治疗等综合治疗措施，治愈率不断提高。然而对于晚期乳腺癌病人，常规治疗措施的效果较为有限，原因在于患者体内肿瘤导致的针对肿瘤的免疫耐受和因此产生的肿瘤免疫逃逸，最终导致肿瘤转移扩散，患者死亡，因此，打破肿瘤免疫耐受是晚期肿瘤病人迫切需要解决的问题。
　　肿瘤转移扩散是导致乳腺癌患者死亡的主要原因，肿瘤免疫逃逸是肿瘤发展和转移的关键性特征。肿瘤诱导机体免疫系统产生针对肿瘤抗原的病态的免疫耐受，逃避免疫清除，其机制较为复杂，相关因素众多，如:抗原丢失，分泌免疫抑制性因子，招募调节性免疫细胞抑制免疫应答，诱导免疫效应细胞凋亡等等。
　　色氨酸分解代谢限速酶吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine2，3-dioxygenase;IDO)近年来逐渐引起重视，被认为是肿瘤免疫逃逸过程中的一条关键性途径[5]。IDO分为IDO1(classic IDO)和IDO2(variant IDO)两种亚型，两亚型在肿瘤细胞均有表达。但仅IDO1有催化色氨酸分解的酶活性，催化循犬尿氨酸途径的色氨酸代谢反应的初始限速步骤[6]。
　　IDO1(classic IDO，经典型)在诱导外周耐受机制中发挥重要的作用。正常状态下，树突状细胞(DCs)组成性表达IDO1，抑制效应T细胞过度增殖，维持机体免疫稳态[7];而在肿瘤发生发展过程中，肿瘤区域引流淋巴结中的DCs以及肿瘤浸润树突状细胞(TIDCs)均过表达IDO1，一些上皮来源的恶性肿瘤细胞高表达IDO1，营造局部免疫抑制状态的肿瘤微环境和肿瘤区域引流淋巴结，通过直接作用于效应T细胞和诱导CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)增殖两方面[8]，导致肿瘤宿主针对肿瘤抗原产生外周耐受(peripheral tolerance)。一方面癌细胞自身过表达IDO1，耗竭细胞外微环境中的色氨酸，导致色氨酸缺乏，诱导效应T细胞凋亡;另一方面，肿瘤微环境中异常存在的PGE2诱导致耐受性DCs过表达IDO1;第三，色氨酸代谢终产物犬尿氨酸通过ROS信号通路抑制CTL细胞增殖，诱导凋亡;而在下调NK细胞杀伤活性方面，可能通过以下三种机制:1.下调NK细胞表面NKp30，NKp44，NKG2D等受体表达，削弱其细胞毒活性，降低其介导的杀瘤活性;2.IDO催化色氨酸分解代谢的终产物L-犬尿氨酸(L-kynurenine)通过活性氧信号转导通路(ROS signal pathway)抑制NK细胞生长，诱导凋亡;3.肿瘤细胞分泌趋化因子Mig、IP-10、及TIDCs分泌趋化物吸引并捕获表达趋化因子受体CXCR3、CXCR4的CD56(bright)NK细胞（调节性NK细胞）进入肿瘤区域引流淋巴结，影响肿瘤细胞的生物学行为，利于肿瘤远处转移[9-12]。
　　成熟DCs和未成熟DCs均组成性表达IDO1，不受色氨酸浓度的影响，也不能被小分子IDO抑制剂1-MT所阻断。有研究发现肿瘤高表达IDO1诱导免疫耐受的过程可被小分子抑制剂1-甲基色氨酸(1.methyl tryptophan，1-MT)阻断[13];在经典两阶段诱发性小鼠炎性皮肤癌模型中，促癌剂TPA诱导的致肿瘤性的慢性炎症中，IDO1高表达，在区域引流淋巴结中，IDO+调节性DCs数量增多;在Ido1-/-的小鼠两阶段诱发性炎性皮肤癌模型中，肿瘤发生低于IDO1表达正常的小鼠[14][15][16]，因此IDO作为免疫抑制因子是细胞恶性转化过程的关键因素，而IDO1基因敲除小鼠同样可被诱发肿瘤，IDO1表达缺失并未加重肿瘤微环境中的炎症反应，说明肿瘤表达IDO是肿瘤发展的充分而非必要条件，在IDO(-)肿瘤微环境中，过表达IDO1的免疫细胞在肿瘤侵袭及远处转移的过程中关键的作用。
　　树突状细胞(DCs)能高效地识别、摄取、加工处理和递呈抗原，激活下游的幼稚T细胞、CTL细胞，NK细胞，处于启动、调控及维持免疫应答的中心环节，是联系天然免疫和获得性免疫的桥梁。DCs并非一种细胞，而是数种表面标志和功能各异的细胞亚群所组成的一个群体。根据其表型、功能、体内组织分布，分为不同亚类。目前一般认为DCs按来源可划分为两类:DC1和DC2，DC1即mDCs(myeloid dendritic cells)，与单核细胞和粒细胞有共同的前体细胞，该前体细胞表达整联蛋白CDllc和GM-CSF受体，在GM-CSF和IL-4在作用下分化为mDCs;DC2，即pDCs(plasmacytoid dendritic cells)，与T细胞和NK细胞有共同的前体细胞——淋巴样前体细胞，该前体细胞不表达CD11c和GM-CSF受体，高表达IL-3受体，在IL-3和CD40配体作用下分化为pDCs.DCs按功能可分为致免疫性DCs(Immunogenic DC)和致耐受性DCs(Tolerogenic DC)，致免疫性DCs在抗肿瘤免疫中激活效应T细胞，改变肿瘤微环境，将Th2应答转化为Th1免疫应答。致耐受性DCs表达IDO，诱导产生Treg细胞[12][17]，下调病原致敏的活化T细胞功能，促其凋亡。DC的这种“双向免疫调控”功能既使机体达到了生理条件下的免疫稳态，但也易被肿瘤所利用而发生免疫逃逸。因此，如何在保持机体免疫稳态的同时避免肿瘤免疫逃逸是较有临床意义的课题。
　　基于DCs的肿瘤免疫治疗一直是研究热点[18,19]，二十多年来，以DCs瘤苗为基础的肿瘤免疫治疗体外及动物试验在淋巴瘤、黑色素瘤和肾细胞癌等恶性肿瘤的治疗被证实有确切疗效，已进入临床试验和临床治疗。然而预期的治疗效果未能达到，几种以DCs为基础的免疫治疗方法临床应答率均低于15％[19-22]，原因之一便在于患者DCs高表达IDO1，在体外制备的自体DCs瘤苗进入患者体内后，被表达CCR7-L的肿瘤细胞趋化至肿瘤微环境，主要发挥其“致耐受性”功能而非“致免疫性”功能，不仅没有治疗作用，反而促进肿瘤进展[23,24]。体外实验发现部分肿瘤患者体内IDO1广泛过表达，其预后较体内IDO水平低的患者更差。过表达IDO1的DCs对NK细胞有细胞毒作用，以促凋亡的方式下调NK细胞数量，以抑制NK细胞介导的杀瘤作用。因此推测，使用基因沉默的方法阻断IDO1基因表达途径，或可抑制致耐受性DCs的功能，从而提高NK细胞杀瘤活性，打破肿瘤免疫耐受状态，协同提高其他抗肿瘤治疗的效能。
　　人外周NK细胞是一类淋巴独特的细胞，表面标志为CD3(-) CD19(-)、CD16(+)CD56(+)，根据细胞表面表达CD56分子的密度分为CD56brightNK和CD56dimNK两个亚群。CD56brightNK细胞约占NK细胞总数的10％，以大量分泌细胞因子为特征，具有免疫调节特性;CD56dimNK细胞约占NK细胞总数的90％，高表达CD16(FcγRⅢ)，介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，具有杀伤活性。NK细胞表面表达多种活化性受体和抑制性受体，抑制性受体特异性识别并结合细胞表面HLA-Ⅰ类分子，识别“自我”，维持机体免疫稳态;活化性受体对丧失自我(missing-self)的肿瘤细胞及病毒感染细胞进行识别和杀伤。
　　在细胞发育过程中，未成熟DCs与静止态NK细胞之间存在相互作用的正反馈激活信号，它们通过NKp30受体-配体相互识别，以细胞-细胞接触和分泌细胞因子两种途径相互作用，活化NK细胞，分泌细胞因子及发挥细胞毒性作用，DCs成熟并极化为DC1(stable type-1 polarized DC)，发挥比非极化DCs更强的抗肿瘤作用[25-28]。静止态NK细胞表达CCR5、CXCR3等趋化因子受体，可被趋化至肿瘤区域引流淋巴结，和DCs通过Ⅰ型IFN信号相互识别，被DCs分泌的IL-15激活，在共刺激分子CD40配体存在下，分泌TNFα和IFNγ等可溶性细胞因子促DCs成熟。如果DCs成熟异常，活化NK细胞则与之发生细胞一细胞接触，发挥细胞毒作用，将其清除。
　　抗肿瘤过程中，致免疫性DCs能有效激活初始型静止性T细胞、CTL细胞和NK细胞，将Th2应答转化为Th1免疫应答，发挥抗肿瘤作用;致耐受性DCs(TolerogenicDCs)通过消耗色氨酸，抑制抗原特异性T细胞增殖，使之不可再激活，并趋向于凋亡，从而抑制效应T细胞免疫应答;分泌IL-10和IL-6，诱导Treg极化，抑制NK细胞的分泌功能和细胞毒功能，利于肿瘤生长[29][30][33]。体外实验发现凋亡肿瘤细胞激活DCs细胞和NK细胞的作用强于细胞裂解物[34]。提示若进一步将DCs-NK免疫治疗与诱导细胞凋亡的化疗、分子靶向治疗联合，或可起到增效作用。
　　本课题以BALB/c小鼠4T1乳腺癌模型为基础，研究乳腺癌小鼠体内NK细胞与DCs相互作用与肿瘤免疫逃逸之间的联系。通过SiRNA沉默IDO1基因表达联合NK细胞过继免疫治疗晚期转移性乳腺癌，通过抑制IDO1表达，改善肿瘤微环境和区域引流淋巴结中的免疫抑制状态，改善肿瘤浸润树突状细胞的功能低下状态，以及通过NK细胞的细胞毒性杀伤作用，达到免疫删除功能异常的致而寸受性树突状细胞的效果。本实验希望能为IDO1基因沉默联合NK细胞过继免疫治疗提供理论基础，为治疗晚期转移性乳腺癌提供新思路。
　　基于IDO1基因沉默的转移性乳腺癌基因免疫治疗及其与DC/NK细胞相互作用关系的研究
　　研究背景:
　　目前，乳腺癌已成为中国女性最常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年升高趋势，发病年龄趋于年轻化。近年来随着治疗手段进步和新药研发，早中期乳腺癌可通过手术、放化疗、内分泌、靶向治疗结合等综合治疗手段获得根治;对于晚期乳腺癌病人，控制病情控制的方法较为有限，往往死于肿瘤转移扩散，原因在于患者体内肿瘤导致的针对肿瘤的免疫耐受和因此产生的肿瘤免疫逃逸。
　　作为免疫抑制因子， IDO1是肿瘤发展过程中的重要因素之一，IDO1过表达被认为是肿瘤免疫逃逸的重要途径。部分肿瘤细胞本身可过表达IDO1，耗竭肿瘤微环境中的色氨酸，产生过量代谢终产物犬尿氨酸，抑制效应T细胞增殖潜能，诱导效应T细胞和NK细胞凋亡;肿瘤微环境中存在的PGE2可诱导肿瘤浸润树突状细胞(TIDCs)过表达IDO1，上调CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)增殖，从而导致针对肿瘤抗原的外周耐受(peripheral tolerance)。有研究显示，在诱发性肿瘤动物模型中，单纯性肿瘤细胞IDO缺失不会加重肿瘤微环境中的炎症反应，对肿瘤发展侵袭转移的影响甚微。因此，有理由相信是肿瘤微环境中过表达IDO的免疫细胞在肿瘤侵袭和远处转移过程中发挥了更大作用。至今以DCs为基础的肿瘤免疫治疗临床试验在多种恶性肿瘤治疗中被证实有效，已进入临床，然而预期的良好疗效并未达到，几种DCs为基础的免疫治疗方法临床应答率均低于15％，考虑与DCs瘤苗趋化进入肿瘤环境(tumor milieu)后，被肿瘤相关抑制因子损伤其功能有关。体外实验发现，在肿瘤患者及负瘤小鼠体内，DCs过表达IDO，催化色氨酸代谢，消耗色氨酸，促NK细胞凋亡，代谢终产物犬尿氨酸对NK细胞有细胞毒作用。本课题以BALB/c小鼠4T1乳腺癌模型为基础，研究乳腺癌小鼠体内NK细胞与DCs相互作用与肿瘤免疫逃逸之间的联系。通过SiRNA沉默IDO基因表达联合NK细胞过继免疫治疗晚期转移性乳腺癌，通过抑制IDO表达，改善肿瘤微环境和区域引流淋巴结中的免疫抑制状态，改善TIDCs功能低下状态，以及通过NK细胞的细胞毒性杀伤作用，对部分功能异常的致耐受性DCs进行免疫清除，希望为IDO1基因沉默联合NK细胞过继免疫治疗提供理论基础，为治疗晚期转移性乳腺癌提供新思路。
　　研究目的:
　　本研究以BALB/c小鼠4T1乳腺癌模型为基础，通过使用SiRNA沉默树突状细胞(DCs)内经典型吲哚胺2，3过氧化酶(IDO1)基因表达的策略，寻求提高自然杀伤(NK)细胞杀瘤活性的方法，从而达到提高NK细胞过继免疫治疗效果的目的，研究乳腺癌小鼠体内NK细胞与DCs之间相互作用及其与肿瘤免疫逃逸的联系，探讨以DCs瘤苗联合NK细胞行过继细胞治疗的可行性。
　　实验方法
　　1.建立小鼠4T1乳腺癌模型:选用6-8周雌性Balb/c小鼠（初始体重20±2克），收集处于对数期生长的4T1细胞，将一定浓度的4T1细胞悬液无菌接种于小鼠第4、9乳房脂肪垫处，以肿瘤最大直径达0.5cm为建立模型成功;
　　2.RT-PCR法和Western Blot法:检测4T1细胞株的吲哚胺2，3过氧化酶(IDO)基因表达;
　　3.构建小鼠IDO1基因SiRNA质粒表达载体。在GenBank中检索小鼠IDO的基因编码序列内源性IDO靶序列:mRNA(GUUCUAGAAGGAUCCUUGA)特异性IDO-siRNA插入片段:sense,5＇-CGCGGTTCTAGAAGGATCCTTGATTCTAGAGATCAAGGATCCTTCTAGAACTTTTTA-3＇antisense,5＇-CAAGATCTTCCTAGGAACTAAGATCTCTAGTTCCTAGGAAGATC TTGAAAAATGATC-3＇，插入片段包含一个特异性靶向IDO mRNA的19-mer发夹结构。
　　4.使用流体力学基因转移法(hydrodynamic injection)进行体内转染:经由小鼠尾静脉，将小鼠IDO基因siRNA质粒表达载体在4-6秒内快速注入小鼠体内。
　　5.使用BD IMag免疫磁珠分选系统，体外分选纯化4T1乳腺癌小鼠体内的DCs和NK细胞。
　　6.Transwell体系共培养:使用0.4μm聚酯透明膜的Transwell板(Corning)共培养体系，将免疫磁珠分选纯化的DCs置于下室中、NK细胞置于上室中，37℃，5％CO2环境下常规培养。
　　7.CCK-8法检测NK细胞杀伤活性: NK细胞活性％=（OD NK试验孔-OD自然释放孔）/（OD最大释放孔-OD自然释放孔）x100％
　　8.AnnexinⅤ-FITC/PI双染法，流式细胞仪检测DCs凋亡。
　　结果:
　　1.RT-PCR法检测示小鼠4T1乳腺癌细胞不表达IDO1基因;Western Blot法检测显示小鼠4T1乳腺癌细胞不表达IDO1蛋白;小鼠4T1乳腺癌细胞为IDO1阴性表达。
　　2.建立肿瘤细胞IDO1表达阴性的小鼠转移性乳腺癌模型:接种4T1细胞悬液部位第4天可触及皮下结节，第7至12天，瘤体增大较迅速，接种部位可触及肿瘤与周围组织粘连。至第12天，小鼠成瘤率达100％，取肿瘤生长良好的小鼠颈椎脱臼处死，进行解剖学检查，接种部位可见原发瘤形成，区域淋巴结肿大，病理学检查可见癌细胞;并可见全身多发部位转移结节。
　　3.在肿瘤细胞IDO1阴性表达的Balb/c小鼠4T1转移性乳腺癌模型中，使用SiRNA策略体内沉默DCs的IDO1基因，联合异体同基因NK细胞行过继免疫治疗。治疗组原发瘤生长缓慢，远处转移率低于生理盐水对照组，差异极为显著(p＜0.01);与单独使用SiRNA策略的处理组2以及单独使用异体同基因NK细胞过继治疗的处理组3比较，有显著性差异（p＜0.05），在使用SiRNA沉默IDO1基因的DCs作用下，NK细胞凋亡减少，杀瘤活性增强，具有显著疗效(p＜0.01)。
　　4.体外实验显示，荷瘤鼠区域引流淋巴结中DCs体外抑制NK细胞杀瘤活性:与对照组（79.42±6.76）％比较，共培养后的NK细胞的杀瘤活性（33.04±5.25）％显著下降(p＜0.05)。来自健康小鼠的同基因异体NK细胞通过诱导凋亡作用杀伤肿瘤浸润DCs。
　　结论:
　　1.使用小鼠4T1转移性乳腺癌模型进行IDO1相关的免疫细胞研究，可排除肿瘤细胞表达IDO1的干扰因素，是研究IDO1相关的免疫细胞相互作用的较为理想动物模型;
　　2.SiRNA沉默DCs的IDO1基因表达联合NK细胞过继免疫策略，治疗小鼠乳腺癌，疗效较为显著，可推迟肿瘤发生时间，延长生存期;
　　3.DCs的IDO1表达被SiRNA沉默后，NK细胞凋亡减少，杀瘤活性增强;
　　4.区域引流淋巴结中的DCs抑制同基因异体NK细胞杀瘤活性;
　　5.NK细胞通过诱导凋亡作用杀伤肿瘤浸润DCs;
　　6.使用SiRNA行IDO1基因沉默联合HLA-相合的NK细胞过继细胞治疗策略可能成为临床肿瘤治疗的有效手段。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 肿瘤细胞IDO1阴性表达的小鼠乳腺癌动物模型的建立

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 SiRNA沉默吲哚胺2，3-过氧化酶基因联合同基因异体自然杀伤细胞过继免疫治疗小鼠乳腺癌的体内研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三 树突状细胞与自然杀伤细胞体外相互作用的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 树突状细胞和自然杀伤细胞之间相互作用与相关肿瘤免疫治疗进展

在学期间科研成绩

致谢

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