阿尔茨海默病过程中单核细胞和T淋巴细胞迁移入脑机制的探讨

摘要

目的：
　　阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种进行性发展的神经退行性疾病，它的发病率约占65-69岁人群的0.6％，70-74岁人群的1.0％，在85岁以上人群中的比例占到了8.4％，从而成为日益突出的公共健康问题。AD的主要病理特征包括进行性记忆减退、认知功能障碍、以及人格改变，影响病人的日常生活。这些症状的出现是神经元死亡的结果，尤其是边缘系统和皮质联合区，这些与记忆相关的部位。
　　AD病因是复杂且多种多样的，发病机制也有很多种解释，目前研究的热点主要集中在AD脑内存在的免疫炎症反应，以及其应用于临床治疗的前景;炎性介质，氧化应激反应，后天获得性免疫之间的相互作用。在AD脑内的病理损伤部位存在着与外周免疫反应相同特征的炎性反应。在外周免疫系统，退化的组织和大量不可溶的非正常物质的沉积都是免疫反应发生的诱因。同样的，在AD脑内，受损的神经元，不可溶性Aβ(amyloidbeta)的沉积和神经缠结等也都可以成为炎症反应发生的诱因。
　　目前有许多证据表明AD伴随着全身性免疫反应，血液中免疫细胞的分布及反应性都会发生变化。神经炎性反应会导致中枢神经系统内的蛋白质，比如Aβ或者炎性介质透过血脑屏障进入外周血。这将导致全身性免疫反应，骨髓源细胞及淋巴细胞进入中枢神经系统积聚。因此，AD病人中枢神经系统和外周免疫系统间的交通将影响免疫细胞在外周血和脑内的分布以及免疫介质的产生。
　　血液来源的免疫细胞在AD发病方面的作用过去常常被忽视，但如今已经非常受到重视。有研究证明APP23转基因小鼠的脑组织中有免疫细胞浸润，其中27％-31％为T细胞，7％是单核细胞，更有研究表明在AD脑内，许多细胞因子和炎性趋化因子水平明显高于正常老年人群。这些证据强烈的提示免疫系统在AD病变的发生发展过程中起着非常重要的作用。
　　AD脑内存在的单核吞噬细胞可以被Aβ以及促炎性因子，炎性趋化因子直接活化，也可以与进入脑内的T淋巴细胞发生“cross-talk”而活化，活化的单核吞噬细胞可以分泌细胞因子影响神经元功能和中枢神经系统炎性反应。因此，针对外周血免疫细胞跨血脑屏障迁移入脑机制的研究有重大科学意义。
　　方法:
　　1、AD病人外周血单核细胞高表达CSF2RB对其跨血脑屏障迁移的影响
　　(1)AD病人外周血单核细胞的分离:选取沈阳地区AD病30例，同年龄健康对照26例，用肝素抗凝处理过的试管，于清晨空腹采肘静脉血，室温放置，采血后3小时内用分离人外周血单核细胞的Dynabeads(@)CD14磁珠试剂盒分离人外周血单核细胞，用Trazol裂解后提取总RNA并委托公司进行基因芯片检测。
　　(2)根据芯片检测结果，筛选有表达差异的基因，并选取其中的CSF2RB基因进行研究。
　　(3)采用定量PCR方法验证AD病人外周血单核细胞中CSF2RB基因表达的变化。
　　(4)利用本课题组制作的AD大鼠模型，术后3天和7天分别采集外周血并分离单核细胞，定量PCR方法验证CSF2RB基因的表达是否与对照组存在差异。
　　(5)利用慢病毒载体，构建特异性CSF2RB基因沉默的RNA干扰质粒，制备得到高滴度的慢病毒颗粒，转染单核细胞株THP-1细胞，建立CSF2RB基因沉默的单克隆细胞系。
　　(6)利用CSF2RB基因沉默的THP-1细胞系进行细胞迁移实验，分析CSF2RB对单核细胞迁移能力的影响。
　　2、探讨AD病人脑内高水平GM-CSF增加血脑屏障通透性的机制
　　(1)将培养的HBMECs在生长状态良好时，接种到Transwell建立体外血脑屏障模型，观察经过GM-CSF处理HBMECs后跨内皮细胞电阻值(TransEndothelial Electrical Resistance, TEER)的变化。
　　(2)采用HRP flux分析GM-CSF处理HBMECs后，体外血脑屏障模型通透性的改变。
　　(3)细胞毒性实验检测GM-CSF对于HBMECs生长是否有影响。
　　(4) GM-CSF处理HBMECs后，分别使用Real-time PCR、Western blot检测粘附连接蛋白VE-cadherin和紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-3、claudin-5的表达水平。
　　(5)扩增ZO-1启动子区域(-2787～+1)，应用双荧光素酶报告基因检测GM-CSF对ZO-1基因转录的调节。
　　(6)Western Blot检测occludin在NP-40可溶型和不可溶型间的转化。
　　(7)免疫共沉淀检测claudin-5泛素化修饰水平。
　　3、探讨AD疾病外周血T淋巴细胞入脑的机制
　　(1)构建Aβ1-42脑内沉积动物模型，免疫荧光检测脑微血管内皮细胞MHC-I表达情况。
　　(2)使用Aβ、BV2培养上清液、Aβ刺激的BV2培养上清液作用HBMECs后，分别使用Real-time PCR、Westem blot检测MHC-I表达水平。
　　(3)构建含有BV2小胶质细胞的体外血脑屏障模型，模拟AD脑微环境对T淋巴细胞系进行迁移分析和粘附分析，并使用MHC-I中和抗体进行抗体封闭实验。
　　(4)使用siRNA干扰HBMECs MHC-I表达，进行T淋巴细胞迁移分析及粘附分析。
　　(5)使用TNF-α中和抗体处理经Aβ刺激的BV2上清，作用HBMECs后，分别使用Real-time PCR、Western blot检测MHC-I表达水平。
　　(6)在Aβ反应性的BV2介导的粘附和迁移实验中，使用TNF-α中和抗体进行封闭实验。
　　结果：
　　1、AD病人外周血单核细胞高表达CSF2RB有助于其跨血脑屏障迁移
　　(1)与同龄对照者相比，AD病人CSF2RB基因表达上调。
　　(2)AD大鼠模型外周血单核细胞中CSF2RB表达上调。
　　(3)慢病毒介导的特异性CSF2RB基因沉默THP-1单克隆细胞株跨血脑屏障迁移的能力下降。
　　2、AD病人脑内高水平GM-CSF改变紧密连接蛋白表达和分布，增加血脑屏障通透性
　　(1)GM-CSF处理HBMECs后跨内皮细胞电阻值降低。
　　(2)GM-CSF处理HBMECs后HRP通过率增高。
　　(3)GM-CSF抑制ZO-1启动子活性，下调ZO-1蛋白表达。
　　(4)GM-CSF增加claudin-5泛素化修饰，促进其降解。
　　(5)GM-CSF促进occludin由NP-40不可溶型向可溶型转化。
　　3、Aβ诱导脑微血管内皮细胞高表达MHC-I，促进外周血T淋巴细胞迁移入脑
　　(1)AD大鼠模型脑微血管内皮细胞高表达MHC-I。
　　(2)Aβ刺激的BV2培养上清可上调HBMECs MHC-I表达水平。
　　(3)使用MHC-I中和抗体及siRNA干扰HBMECs MHC-I，能够抑制T淋巴细胞MHC-I依赖性的迁移及粘附。
　　(4)Aβ可上调小胶质细胞TNF-α表达，并引起HBMECs MHC-I表达增加。
　　(5)TNF-α中和抗体能够抑制Aβ反应性小胶质细胞介导的T淋巴细胞迁移及粘附。
　　结论：
　　l、AD病人外周血单核细胞穿过血脑屏障与GM-CSF/CSF2RB轴密切相关;
　　2、Aβ诱导脑微血管内皮细胞高表达MHC-I促进T淋巴细胞跨内皮迁移。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 单核细胞穿过血脑屏障与GM-CSF／CSF2RB轴密切相关

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 Aβ诱导脑微血管内皮细胞高表达MHC-Ⅰ促进T细胞跨内皮迁移

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 免疫细胞在痴呆中的作用

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